Мы предлагаем простое и эффективный протокол для генерации человеческих макрофагах. Лейкоцитарных пленок обрабатываются с помощью двойного центрифугирования в градиенте плотности и изолированные моноциты затем дифференцируются в макрофаги в тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешков. Это максимизирует доходность макрофагов и способствует сбор клеток для последующих экспериментов.
Человека макрофаги участвуют в многочисленных патологических процессов, начиная от инфекционных заболеваний к раку. Таким образом, они представляют собой ценный инструмент, чтобы понять основные механизмы этих заболеваний. Поэтому мы представляем простой протокол для выделения человеческих моноцитов из лейкоцитарных пленок, а затем с помощью процедуры дифференциации, что приводит к высоким выходам макрофагов. Эта технология основана главным образом на общедоступных лабораторного оборудования и, таким образом, представляет собой экономически и времени эффективный способ получения больших количеств человеческих макрофагах. Вкратце, лейкоцитарных пленок от здоровых доноров крови, подвергают двойной центрифугированием в градиенте плотности для сбора моноцитов из периферической крови. Эти моноциты культивировали в то фторированных этилен-пропилен (ФЭП) с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешков в присутствии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF). Дифференцированные макрофаги могут быть легко собирать и использовать для последующих исследований и функциональным,говорит. Важные методы контроля качества и проверки достоверности выделения и дифференциации шагов будут выделены в рамках протокола. Таким образом, протокол, описанный здесь позволяет ученым регулярно и воспроизводимо изолировать человека макрофаги без необходимости дорогостоящего инструмента. Более того, модели болезни могут быть изучены в сингенных человеческой системы в обход использование мышиных макрофагов.
Клетки из моноцитов линии и их терминально дифференцированных производных – макрофаги – проявляют поразительное пластичность в отношении их биологической функции, что приводит к их участия в таких разнообразных процессов, как развитие, восстановления тканей, и иммунитета 1. Последнее связано с их фагоцитарной и антигенпрезентирующей способности, которые ставит макрофаги на перекрестке между врожденной и адаптивной иммунной реакции 2. Тем не менее, их способность к секреции цитокинов, хемокинов, факторов роста и другие сигнальные молекулы 1 не только увеличивает свою функцию иммунной модулирующее, но также служит в качестве основы для их дополнительными функциями. Попытки отразить эти разнообразные шаги активации в контексте не-микробных опосредованных условий привели к категории М1 и М2 3. Хотя эта классификация не является полной, она позволяет базового понимания макрофагов биологии.
В связи с этим многогранных возможностей это неудивительно, что макрофаги, связанной со многими условиями, которые в некотором роде вовлечено ремоделирование тканей или воспаление. Рядом с их фундаментальной роли в признании и оформления вторжения патогенов 4-6, макрофаги все чаще в центре внимания в атеросклероз, фиброз, ожирения и рака 7-10. Воспроизводимый метод для генерации человеческих макрофагах Поэтому крайне важно для понимания этих патологий. Здесь мы представляем метод, основанный на выделении человеческих моноцитов из периферической крови здоровых доноров по методике двойной градиент плотности центрифугирования, как описано выше 11. Для того чтобы облегчить дифференцировку макрофагов в сторону, изолированные моноцитов клетки инкубируют в присутствии низких концентраций M-CSF и нормальной сыворотке человека 12. Чтобы облегчить дальнейшее обращение и урожай клеток, дифференцировка осуществляется в газопроницаемых FEPС тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешки с гидрофобной поверхности 12-15. Полученные отдыха макрофаги могут быть подвергнуты широком диапазоне анализов, как они все еще способны реагировать либо в моде М1 или М2-типа. Альтернативные методы выделения моноцитов и последующей дифференциации, такие как магнитный сортировка клеток (MACS) или противоточных центробежный вынос (CCE) имеют некоторые ограничения относительно урожайности, стоимость и время, необходимое. Протокол описано здесь имеет то преимущество, что она может быть осуществлено с помощью стандартного лабораторного оборудования без необходимости в специальных реагентов (например, MACS магнитных шариков) или устройств (например, CCE аппаратуры) и учитывает при обработке больших количеств клеток.
Макрофаги являются важными эффекторными клетками врожденной иммунной системы и отображать важные функции в иммуномодуляции, презентации антигена и тканевого гомеостаза. Благодаря своей замечательной пластичности, они способны реагировать на различные стимулы с изменением их фенотипа. Тем не менее, до сих пор много данных о макрофагов поляризации получаются в мышиной системы, хотя есть отчеты, показывающие, что только около 50% из макрофагов маркеров поляризационных могут быть непосредственно переведены из мыши с человеческим 16. Таким образом, мы приводим здесь метод получения первичных человеческих макрофагов в достаточном количестве и чистоты без необходимости в дорогостоящих материалов, например, Mac магнитных шариков или противотока центробежной сепарации устройства.
Метод основан на выделении моноцитов из РВМС и их последующей дифференциации в макрофагах в FEP с тефлоновым покрытием клеточных культур мешки в присутствии низкой Concentrations из M-CSF 11-13. В то время как моноциты составляют менее 5 до 10% лейкоцитов периферической крови в организме человека, при стимуляции их вербовали в периферийных участках, где они дифференцируются в резидентных макрофагов тканей или дендритных клеток 17. Цитокин M-CSF имеет важное значение для выживания моноцитов и приводит их дифференцировку в макрофаги 18,19. Пока концентрация M-CSF, которые были выбраны для моноцитов дифференциации варьировались до 100 нг / мл, однако, в нашем протоколе мы можем получить достаточное количество зрелых макрофагов с концентрацией M-CSF лишь 2,5 нг / мл 12 , 20. Кроме того, клетки культивируют в ФЭП с тефлоновым покрытием для культивирования клеток мешки, которые облегчают отделение макрофагов и их последующего посева в определенных количества клеток. Поскольку пакеты могут быть использованы несколько раз, это дальнейшее сокращение расходов на процессе выделения.
Макрофаги, полученные по этой методикевесьма позитивным для CD45, CD14, CD11b, CD11c и показать экспрессию рецептора маннозы CD206, который утверждает, что в стране проживает чистых, зрелых макрофагов 21,22. Особенно высокий уровень экспрессии CD14 является типичным для макрофагов дифференцированных в присутствии M-CSF 23. После посева клеток, они показывают быстрый приверженность пластиковых поверхностей с некоторых клеток с типичной шпинделя морфологию, а другие проявляют жареную фенотип яйца. Это в соответствии с замечаниями от других авторов 18,22,24.
Было сообщено, что моноциты дифференциация в присутствии M-CSF приводит к M2-поляризованных макрофагов 16,25. Тем не менее, макрофаги, изолированные от нашего протокола все еще способны реагировать на широкий круг раздражителей, включая воздействие клеток, полученных микропузырьков опухолевых и совместного культивирования с опухолевыми клетками или 26,27 воздействием ЛПС, к которым они вступают в реакцию с индукцией про- воспалительные гены, такие как IL-1 и# 946 ;, ФНО, Wnt5a, или различные матричные металлопротеиназы, которые считаются типичными для M1-поляризованных макрофагов 3,5,28.
В заключение, выделение моноцитов по двойным центрифугированием в градиенте плотности и последующей дифференциации в направлении макрофагов в ФЭП с тефлоновым покрытием для культивирования клеток сумки приводит к большим числом макрофагов без необходимости технически трудно или дорого процедур. Полученные макрофаги могут быть использованы для последующего анализа, начиная от классической активации через ЛПС в совместной культуре с опухолевыми клетками.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Майке Schaffrinski для ее всегда отличной технической помощи в течение последних нескольких лет.
Эта работа финансировалась через Немецкого научно-исследовательского совета (DFG) в рамках совместных исследований группы 942 (FOR942) и Программой научно-исследовательского факультета медицины, Георг-Августа-университета Геттингена.
antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |