عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة
Summary
نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلية لتجارب لاحقة.
Abstract
وتشارك الضامة الإنسان في عدد كبير من العمليات مرضية تتراوح من الأمراض المعدية إلى السرطان. وبالتالي فإنها تشكل أداة قيمة لفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأمراض. لذا نقدم بروتوكول اضحة لعزل حيدات الإنسان من المعاطف الشهباء، يليها إجراء المفاضلة مما يؤدي إلى عوائد عالية البلاعم. وتعتمد هذه التقنية في الغالب على معدات المختبرات المتاحة عموما وبالتالي يوفر التكلفة والوقت فعالة طريقة للحصول على كميات كبيرة من الضامة الإنسان. باختصار، يتعرض المعاطف الشهباء من المتبرعين بالدم صحية إلى مضاعفة كثافة التدرج الطرد المركزي لحصاد حيدات من الدم المحيطي. هذه حيدات ثم يتم تربيتها في المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود) أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون بحضور بلعم عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF). الضامة متباينة يمكن حصادها بسهولة واستخدامها لدراسات لاحقة وظيفية ويقول. وسيتم تسليط الضوء طرق هامة لمراقبة الجودة والتحقق من العزلة والتمايز الخطوات ضمن البروتوكول. وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا تمكن العلماء من عزل بشكل روتيني وبتكاثر الضامة الإنسان دون الحاجة إلى أدوات مكثفة التكلفة. وعلاوة على ذلك، ونماذج المرض يمكن دراستها في النظام البشري مسانج التحايل على استخدام الضامة الفئران.
Introduction
خلايا من سلالته الوحيدات والتي متباينة عضال مشتق – الضامة – تبدي مرونة لافتة في الصدد إلى وظائفها البيولوجية، مما يؤدي إلى مشاركتهم في هذه العمليات متنوعة والتنمية، وإصلاح الأنسجة، والحصانة 1. ومن المقرر أن أكلة وقدرتها العارضة للمستضد الذي يضع الضامة في مفترق الطرق بين الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية (2) والأخير. ومع ذلك، قدرتها على إفراز السيتوكينات، كيموكينات، عوامل النمو، والجزيئات الأخرى 1 يشير ليس فقط وظيفة تقوي المناعة تغييري ولكن أيضا بمثابة أساس لوظائف إضافية لهم. محاولات لتعكس هذه الخطوات تفعيل المتنوعة في سياق غير الميكروبية-الظروف بوساطة أدت في الفئات M1 و M2 3. في حين أن هذا التصنيف ليست كاملة، لأنها تتيح فهم أساسي من البلاعم علم الأحياء.
بسبب هذه القدرات المتعددة الأوجه أنه لم يكن مفاجئا أن الضامة ترتبط مع العديد من الظروف التي في بعض الطريق تنطوي على إعادة عرض الأنسجة أو التهاب. بجانب دور أساسي في الاعتراف والتخليص غزو مسببات الأمراض 4-6، الضامة قد يأتي على نحو متزايد إلى التركيز في تصلب الشرايين، والتليف، والسمنة، والسرطان 7-10. وهناك طريقة استنساخه لتوليد الضامة الإنسان هو بالتالي حاسما لفهم هذه الأمراض. نحن هنا نقدم وسيلة تقوم على عزل حيدات الإنسان من الدم المحيطي من المتبرعين الأصحاء بواسطة تقنية التدرج الكثافة الطرد المركزي مزدوجة كما هو موضح سابقا 11. من أجل تسهيل التمايز نحو الضامة، يتم تحضين الخلايا الوحيدات المعزولة في وجود تركيزات منخفضة من M-CSF والمصل البشري العادي 12. لتخفيف مزيد من التعامل وحصاد الخلايا، ويتم التفريق في محطة إثراء الوقود الغاز قابلة للاختراقأكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون مع سطح مسعور 12-15. الضامة يستريح الناتجة يمكن أن تخضع لمجموعة واسعة من فحوصات لأنها لا تزال قادرة على الاستجابة في إما M1 أو M2 مثل الموضة. طرق بديلة لعزل الوحيدات والتمايز اللاحق مثل المغناطيسية تنشيط الخلايا الفرز (MACS) أو معاكس تصويل الطرد المركزي (CCE) لديها بعض القيود فيما يتعلق العائد والتكلفة والوقت المطلوب. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر ميزة أنه يمكن تنفيذها مع المعدات المختبرية القياسية دون الحاجة للمواد الخاصة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش حبات مغناطيسية) أو أجهزة (على سبيل المثال، جهاز CCE) ويسمح لتجهيز كميات كبيرة من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الضامة هي خلايا المستجيب الهامة من نظام المناعة الفطري وعرض وظائف مهمة في تعديل مناعي، عرض المستضد وتوازن الأنسجة. بسبب اللدونة لها ملحوظة، فهي قادرة على الاستجابة للمؤثرات مختلفة مع التغيرات في النمط الظاهري بهم. ومع ذلك، يتم الحصول حتى الآن الكثير من البيانات المتعلقة بلعم الاستقطاب في النظام الفئران، وإن كانت هناك تقارير تبين أن حوالي 50٪ فقط من علامات الاستقطاب البلاعم يمكن ترجمتها مباشرة من الفأر إلى الإنسان 16. لذا، نقدم هنا طريقة للحصول على الضامة الإنسان الأولية في عدد ونقاء كافية دون الحاجة إلى المواد باهظة الثمن، على سبيل المثال، MACS حبات مغناطيسية أو معاكس جهاز تصويل الطرد المركزي.
ويستند أسلوبنا على عزل حيدات من PBMCs والتمايز لاحقا إلى الضامة في محطة إثراء الوقود أكياس زراعة الخلايا تفلون المغلفة في حضور منخفضة بغية دراسته واقرارهntrations من M-CSF 11-13. بينما حيدات تشكل أقل من 5 إلى 10٪ من الكريات البيض الدموية المحيطية في البشر، على التحفيز وتجنيدهم إلى مواقع هامشية حيث التفريق الأنسجة الضامة إلى المقيمين أو الخلايا الجذعية 17. خلوى M-CSF مهم لبقاء الوحيدات ويقود التمايز لالضامة 18،19. حتى الآن، وتراوحت تركيزات M-CSF التي تم اختيارها لالوحيدات التمايز تصل إلى 100 نانوغرام / مل، ولكن في بروتوكول لدينا ونحن قادرون على الحصول على أعداد كافية من الضامة ناضجة مع تركيز M-CSF فقط 2.5 نانوغرام / مل 12 20. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا المستزرعة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة أكياس ثقافة الخلية التي تسهل من عملية فصل الضامة والبذر في وقت لاحق في أعداد الخلايا المحددة. منذ أكياس يمكن إعادة استخدامها عدة مرات، وهذا يقلل كذلك تكاليف عملية العزلة.
الضامة التي حصل عليها هذا الإجراءهي ايجابية للغاية لCD45، CD14، CD11b، وإظهار CD11c والتعبير عن مستقبلات المانوز CD206 التي تقول لسكان نقية، الضامة ناضجة 21،22. خاصة ارتفاع التعبير CD14 هو الحال بالنسبة للالضامة متباينة في وجود M-CSF 23. بعد زرع الخلايا، لأنها تكشف التقيد سريع على الأسطح البلاستيكية مع بعض الخلايا تظهر مثل مغزل مورفولوجيا نموذجية، والبعض الآخر يحمل النمط الظاهري البيض المقلي. هذا هو وفقا لملاحظات من مؤلفين آخرين 18،22،24.
أفيد بأن التمايز الوحيدات في حضور M-CSF يؤدي إلى الاستقطاب-M2 الضامة 16،25. ومع ذلك، فإن الضامة معزولة بسبب بروتوكول لدينا ما زالت قادرة على الاستجابة لمجموعة واسعة من المحفزات بما في ذلك التعرض لورم microvesicles المشتقة من خلية وثقافة مشتركة مع الخلايا السرطانية 26،27 أو التعرض لLPS التي تتفاعل مع تحريض المؤيدة الجينات الالتهابية مثل IL-1 &# 946؛، TNFα، Wnt5a، أو مختلف مصفوفة metalloproteinases التي تعتبر نموذجية لالضامة M1-الاستقطاب 3،5،28.
في الختام، عزل مزدوج حيدات بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج والتمايز اللاحق نحو الضامة في محطة إثراء الوقود تفلون المغلفة زراعة الخلايا أكياس النتائج في أعداد كبيرة من الضامة دون الحاجة إلى إجراءات صعبة أو مكلفة من الناحية الفنية. ويمكن استخدام الضامة التي تم الحصول عليها لتحليلها لاحقا تتراوح بين الكلاسيكية من خلال تفعيل LPS إلى ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة مايكه Schaffrinski لها المساعدة التقنية ممتازة دائما خلال السنوات القليلة الماضية.
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال مجلس البحوث الألمانية (DFG) ضمن مجموعة البحوث المشتركة 942 (FOR942) وبرنامج البحوث في كلية الطب، جورج-أغسطس جامعة غوتنغن.
Materials
| antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
| BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
| Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
| calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
| combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
| 1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
| 10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
| cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
| Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
| LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
| Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
| Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
| Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
| rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
| RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
| sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
| Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).
- Lionakis, M. S., et al. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).
- Blumenthal, A., et al. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).
- Lima, D. S., et al. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).
- Subramanian, V., Ferrante, A. W. Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).
- Pradere, J. P., et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).
- Danciger, J. S., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).
- Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).
- Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).
- van der Meer, J. W., et al. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).
- van der Meer, J. W., et al. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Tushinski, R. J., et al. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).
- Rietkotter, E., et al. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).
- Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475 (2009).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656 (2012).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Chernykh, E. R., et al. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?. Cell Ther Transplant. 2, (2010).
- Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Pukrop, T., et al. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).
- Hagemann, T., et al. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).
- Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).
