בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון
Summary
אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.
Abstract
מקרופאגים אדם מעורבים בשפע של תהליכים פתולוגיים הנעים בין מחלות זיהומיות לסרטן. כך הם מהווים כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס של מחלות אלו. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידודה של מונוציטים אנושיים ממעיילים באפי, ואחריו הליך בידול וכתוצאה מכך תשואות מקרופאג גבוהות. הטכניקה מסתמכת בעיקר על ציוד מעבדה זמין בדרך כלל ובכך מספקת דרך עלויות וזמן אפקטיבית להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים אנושיים. בקצרה, מעילי אפים מתורמי דם בריאים נתונים לצנטריפוגה כפולה שיפוע צפיפות למסוק מונוציטים מהדם ההיקפי. מונוציטים אלה בתרבית, בשקיות fluorinated פרופילן אתילן (FEP) מצופי טפלון תרבית תאים בנוכחות גורם macrophage-stimulating מושבה (M-CSF). ניתן לקצור מקרופאגים המובחנים בקלות ולהשתמש בהם ללימודים ופונקציונליים כמו שלאחר מכןאומר. שיטות חשובות לבקרת איכות ואימות של צעדי הבידוד ובידול יהיו מודגשות בתוך הפרוטוקול. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים באופן שיגרתי וreproducibly לבודד מקרופאגים אנושיים ללא הצורך בכלי עלות האינטנסיבית. יתר על כן, ניתן ללמוד מודלים של מחלות במערכת אנושית syngeneic עקיפת השימוש במקרופאגים עכבריים.
Introduction
תאים משושלת monocytic והנגזרים סופני מבודלים שלהם – מקרופאגים – תערוכת פלסטיות מדהימה בכל קשור לתפקוד הביולוגי שלהם, שמובילה למעורבותם בתהליכים מגוונים כגון פיתוח, תיקון רקמות, וחסינות 1. האחרון הוא עקב phagocytic ויכולת הצגת אנטיגן אשר מציבה מקרופאגים בצומת שבין תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות 2. עם זאת, היכולת שלהם להפריש ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, ומולקולות איתות אחרות 1 לא רק מגביר את תפקוד מערכת החיסון-modulatory, אלא גם משמש כבסיס לפונקציות נוספות שלהם. מנסה לשקף את הפעולות הבאות מגוונות הפעלה בהקשר של תנאים בתיווך שאינם חיידקים גרמו בקטגוריות M1 ו M2 3. בעוד סיווג זה אינו שלם, היא מאפשרת להבנה בסיסית של הביולוגיה מקרופאג.
בשל היכולות רבת הפנים האלה זה לא מפתיע שמקרופאגים קשורים למצבים רבים שבדרך כלשהי כרוכה שיפוץ רקמות או דלקת. הבא לתפקיד הבסיסי שלהם בהכרה ובאישור של פתוגנים הפולשים 4-6, מקרופאגים הגיעו יותר ויותר למוקד בטרשת עורק, סיסטיק, השמנת יתר, וסרטן 7-10. שיטה לשחזור לדור של מקרופאגים האנושיים לכן חיונית להבנה של פתולוגיות אלה. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על הבידוד של מונוציטים אנושיים מהדם ההיקפי של תורמים בריאים על ידי טכניקה כפולה צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפי שתואר לעיל 11. על מנת להקל על בידול כלפי מקרופאגים, תאי monocytic המבודדים מודגרת בנוכחות ריכוזים נמוכים של M-CSF וסרום אנושי נורמלי 12. כדי להקל עוד יותר טיפול וקציר תא, התמיינות מתבצעת בFEP החדיר הגזשקיות תרבית תאים מצופים טפלון עם משטח הידרופובי 12-15. יכולים להיות נתונה מקרופאגים נחים וכתוצאה מכך למגוון רחב של מבחני כפי שהם עדיין מסוגלים להגיב בכל אופנת M1 או כמו-M2. יש להם שיטות אלטרנטיביות של בידוד מונוציטים ובידול שלאחר מכן, כגון תא מופעל מגנטי מיון (MACS) או נגדי elutriation צנטריפוגלי (CCE) מגבלות מסוימות לגבי התשואה, העלות, והזמן הנדרש. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מציע את היתרון שניתן לבצע אותו עם ציוד מעבדה סטנדרטי ללא הצורך בחומרים כימי מיוחדים (למשל, מקים חרוזים מגנטיים) או התקנים (לדוגמא, מנגנון CCE) ומאפשר לעיבוד של כמויות גדולות של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המקרופאגים הם תאי מפעיל חשובים של מערכת החיסון המולדת ולהציג תפקידים חשובים במשפר תפקוד מערכת חיסון, הצגת אנטיגן והומאוסטזיס רקמה. בשל הפלסטיות המדהימה שלהם, הם מסוגלים להגיב לגירויים שונים עם שינויים של הפנוטיפ שלהם. עם זאת, עד כה הרבה נתונים לגבי קיטוב מקרופאג מתקבלים במערכת העכברית, אם כי יש דיווחים שהראו כי רק כ 50% מסמני קיטוב מקרופאג יכולים להיות מתורגמים ישירות מעכבר ל16 אנושיים. לכן, אנו מציגים כאן שיטה כדי להשיג מקרופאגים אנושיים ראשוניים במספר ובטהרה מספקים ללא הצורך בחומרים יקרים, למשל, חרוזים מגנטיים MACS או מכשיר elutriation צנטריפוגלי נגדי.
השיטה שלנו מבוססת על הבידוד של מונוציטים מPBMCs והבידול הבא שלהם למקרופאגים בFEP הטפלון מצופים שקיות תרבית תאים בנוכחות conce הנמוךntrations של M-CSF 11-13. בעוד מונוציטים מהווים פחות מ -5 10% מכדוריות דם לבנות בדם היקפי בבני אדם, על גירוי שהם מגויסים לאתרים היקפיים שבו הם לבדל למקרופאגים רקמת תושב או תאים דנדריטים 17. ציטוקינים M-CSF הוא חשובים להישרדות מונוציטים ומניעים את הבידול שלהם למקרופאגים 18,19. עד כה, ריכוזי M-CSF שנבחרו לבידול מונוציטים נעו עד 100 ng / ml, לעומת זאת, בפרוטוקול שלנו אנו מסוגלים להשיג כמות מספקת של מקרופאגים הבוגרים עם ריכוז M-CSF של רק 2.5 ng / ml 12 , 20. בנוסף, תאים בתרבית בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP המאפשרות הניתוק של מקרופאגים והזריעה הבאה שלהם במספרים סלולריים שהוגדרו. מאז ניתן לעשות שימוש חוזר בשקיות כמה פעמים, זה מקטין עוד יותר את העלויות לתהליך הבידוד.
מקרופאגים מתקבלים על ידי הליך זהחיוביים מאוד עבור CD45, CD14, CD11b, CD11c ולהראות ביטוי של CD206 קולט מנוז אשר טוען לאוכלוסייה של מקרופאגים הטהורים, בוגרים 21,22. במיוחד ביטוי CD14 גבוה אופייני למקרופאגים מובחנים בנוכחות M-CSF 23. לאחר הזריעה של התאים, הם מציגים את דבקות מהירה למשטחי פלסטיק עם כמה תאים מראים מורפולוגיה כמו ציר טיפוסי, בעוד שאחרים מפגינים פנוטיפ ביצה מטוגן. זה בהתאם לתצפיות ממחברים אחרים 18,22,24.
נמסר כי בידול מונוציטים בנוכחות M-CSF גורם למקרופאגים מקוטבים-M2 16,25. עם זאת, מקרופאגים המבודדים על ידי הפרוטוקול שלנו עדיין מסוגלים להגיב למגוון רחב של גירויים הכוללים חשיפה לmicrovesicles שמקורן בתאי גידול והתרבות משותפת עם תאי גידול 26,27 או חשיפה לLPS שאליו הם מגיבים עם גיוס של הפרו גנים דלקתיים כגון IL-1 &# 946 ;, TNFα, Wnt5a, או metalloproteinases מטריצה השונים שנחשבים אופייניות למקרופאגים מקוטבים-M1 3,5,28.
לסיכום, את בידודה של מונוציטים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות הכפולה והבחנה שלאחר מכן לכיוון מקרופאגים בתוצאות שקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP במספרים גבוהים של מקרופאגים ללא הצורך בהליכים קשים או יקרים מבחינה טכנית. מקרופאגים שהושגו יכולים להיות מנוצלים לניתוח שלאחר מכן החל הפעלה קלאסית דרך LPS לתרבות המשותפת עם תאים סרטניים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לגב 'מיקה Schaffrinski לקבלת הסיוע הטכני תמיד המעולה שלה במהלך השנים האחרונות.
עבודה זו מומנה על ידי המועצה הגרמנית למחקר (DFG) בקבוצת המחקר המשותף 942 (FOR942) ועל ידי תכנית המחקר של הפקולטה לרפואה, גטינגן גיאורג אוגוסט-אוניברסיטה.
Materials
| antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
| BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
| Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
| calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
| combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
| 1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
| 10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
| cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
| Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
| LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
| Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
| Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
| Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
| rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
| RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
| sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
| Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).
- Lionakis, M. S., et al. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).
- Blumenthal, A., et al. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).
- Lima, D. S., et al. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).
- Subramanian, V., Ferrante, A. W. Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).
- Pradere, J. P., et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).
- Danciger, J. S., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).
- Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).
- Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).
- van der Meer, J. W., et al. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).
- van der Meer, J. W., et al. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Tushinski, R. J., et al. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).
- Rietkotter, E., et al. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).
- Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475 (2009).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656 (2012).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Chernykh, E. R., et al. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?. Cell Ther Transplant. 2, (2010).
- Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Pukrop, T., et al. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).
- Hagemann, T., et al. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).
- Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).
