Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

1 Bereiding van steriel menselijk AB serum Verzamel 4-5 zakken van vers bevroren plasma (FFP). WINKEL zakken bij -20 ° C totdat zijn voldoende zakken verzameld. Ontdooi zakken en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 ° C in een waterbad om complement te inactiveren en verwijderen fibrine. Grondig ontsmetten de buitenkant van de zakken en breng het plasma tot 50 ml buizen. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te ontdoen van precipitaten en plaatjesresten. Bundelen alle bovenstaande vloeistoffen en gooi de pellets. Aliquot serummonsters in 15 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: U kunt de handel verkrijgbare warmte geïnactiveerd normaal menselijk AB-serum worden gebruikt. 2 Isolatie van monocyten Om in evenwicht brengen van de centrifuge te vergemakkelijken, is het raadzaam om twee buffycoats parallel verwerken. Echter, neem care afzonderlijke materialen voor elke donor en niet de cellen te mengen. Indien buffy coats niet gemakkelijk kan worden verkregen, kan 400 ml gehepariniseerd perifeer bloed worden gebruikt. Desinfecteren voorzichtig de plastic zakken met de buffycoats en breng de inhoud van elk buffycoat twee buizen van 50 ml. Per buffy coat vullen drie 50 ml buizen met 15 ml Ficoll-oplossing (1,077 g / ml). De Ficoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding. Layer 30-35 ml van de bufferlaag bloed bovenop de Ficoll oplossing voor de eerste dichtheidsgradiënt. Zorg er voor dit langzaam en voorzichtig doen om te voorkomen dat het mengen van beide lagen. Centrifugeer bij 400 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis. Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 40 ml in totaal. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur. Zuig supernatant en was pellet opnieuw met 40 ml PBS-EDTA (1 mM). Voor elke donor zwembad de pellets in 20 ml RPMI-1640 zonder fenol rood + 10% FCS. Bereid de iso-osmotisch Percoll oplossing voor het tweede dichtheidsgradiënt: Twee donors meng 23,13 ml Percoll-oplossing (dichtheid: 1,131 g / ml) in een 50 ml buisje met 1,87 ml 10-voudig PBS. Vervolgens over 23 ml van deze oplossing tot een nieuwe buis van 50 ml en voeg 27 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS tot een 46% iso-osmotisch Percoll oplossing. De Percoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding. Voor elke donor overdracht 25 ml van de bereide Percoll oplossing in een 50 ml buisje en laag het PBMC oplossing bereid 2.9) bovenop de Percoll oplossing. Wees voorzichtig om dit heel langzaam een ​​doend voorzichtig beide lagen de neiging om gemakkelijk mengen. Indien correct gedaan de twee fasen worden onderscheiden door hun verschil in kleur. Centrifugeer bij 550 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van monocyten die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis. Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 50 ml in totaal. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellets in 20 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS. 3 differentiatie van monocyten tot macrofagen Bepaal het aantal geïsoleerde monocyten in een 1:10 verdunning in trypaanblauw. Tellen alleen de grote, vaak onregelmatig gevormde cellen, die monocyten zijn. Reken er maar niet de kleinere, ronde-vormige cellen die lymfocyten. NOTE: Monocyt nummers niet al te nauwkeurig bepaald omdat ze alleen een hint over hoeveel en welke FEP Teflon beklede zakken (kleine of grote) moeten worden gebruikt voor de differentiatie van de cellen bevatten. Voor 1,0-1,5 x 10 8 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een grote FEP Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 174 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 180 ml). Voor 3,0-5,0 x 10 7 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een kleine Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 28,5 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 30 ml). OPMERKING: Als bijvoorbeeld 8,0 x 10 7 monocyten worden verkregen, adviseren wij om ze te zaaien in two kleiner volume zakken 4,0 x 10 7 cellen per. In plaats van M-CSF, monocyten kan ook worden gedifferentieerd granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF) en dezelfde concentratie (2,5 ng / ml). Voeg de celsuspensie (20 ml) op de voorbereide medium en meng voorzichtig. Als twee zakken bereid uit een donor, voeg 20 ml RPMI-1640 aan de celsuspensie en voeg de helft van de suspensie aan elk medium bereiding. Optioneel: Om te bepalen of monocyt preparaat steriel gebleven, scheur een druppel van de celsuspensie op een bloed agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C. Draai het omhulsel van een 50 ml perfusiespuit op de stekker van de FEP Teflon-coating celcultuur zak en vul het met de voorbereide celsuspensie. Haal de stekker van de spuit en druk de resterende lucht uit de zak. Sluit de zak met een afsluitende kegel. Incubeer de zakken voor 6-7 dagen bij 3776, C met 5% CO2. 4 Macrophage Harvest Plaats de FEP Teflon beklede celkweek zakjes gedifferentieerde macrofagen op ijs gedurende ten minste 1 uur tot onthechting van de cellen (een incubatietijd van maximaal 3 uur mogelijk) te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de zak is bedekt met ijs. Trek de zak met minimale druk 10x over de rand van een bureau / board. Desinfecteren voorzichtig de buitenkant van de verpakking en verwijder het sluiten kegel. Draai een 50 ml spuit op de stekker van de zak, verwijder de celsuspensie, en overbrengen naar 50 ml buizen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur verminderde snelheid van de cellen. Zuig het supernatant en verzamel het pellets ve zak in 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS in totaal. Bepaal het aantal cellen in een hemocytometer (1: 4-1: 10 verdunning in trypan blauw). Tellen alleen de grote ronde cellen. OPMERKING: Na differentiatie van macrofagen in de FEP Teflon beklede zakken, kan er residuele cellen bijvoorbeeld lymfocyten, afhankelijk van de donor en de kwaliteit van de monocyt isolatie. Om de FEP Teflon-coating zakken hergebruiken, was ze twee keer met 70% ethanol om de resterende cellen te verwijderen. Vul ze met 50 ml 70% ethanol en incubeer overnacht. Was de zakken 3x met steriel PBS, wikkel ze in sterilisatie papier, en steriliseren in een autoclaaf met behulp van standaard procedures. OPMERKING: De celkweek zakken kunnen meerdere malen hergebruikt worden zonder verlies van macrofagen opbrengsten. Echter, hebben we besloten om de zakken gooi deze na 10 gebruikt voordat ze beginnen te lekken. Voor vervolgexperimenten cultuur macrofagen in RPMI-1640 + 10% FCS. Als lagere serumconcentraties vereist, cultuur in RPMI-1640 met 1% FCS is ook mogelijk. Zaad en incubeer cellen voor 3-4 uur. Na deze periode mee dat macrofagen hechten aan het oppervlak van de celkweekschaal terwijleventuele contaminerende cellen (bijvoorbeeld erythrocyten, lymfocyten en dendritische cellen) blijven in suspensie. Was de cellen ten minste tweemaal met PBS om niet-hechtende cellen te verwijderen. Om macrofagen uit de celkweek schotel voor verdere experimenten los voorzichtig afkrabben van het oppervlak. Alternatief incubeer schotels voor 20 min op ijs, zuig het kweekmedium en voeg 1 ml enzymvrije celdissociatiebuffer. Na 5 minuten incubatie bij 37 ° C wordt 4 ml PBS en los cellen door pipetteren en neer ten minste 3 minuten.