ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

滅菌ヒトAB血清の調製新鮮凍結血漿（FFP）の4-5袋を収集します。 -20℃で保存袋に十分な袋が収集されるまで。 袋を解凍し、補体を不活性化し、フィブリンを除去するために水浴中で56℃で30分間インキュベートする。 徹底的に袋の外側を消毒し、50mlチューブにプラズマを移す。 析出物や残留血小板を取り除くために、室温で15分間、3000×gで遠心分離します。 すべての上清をプールし、ペレットを捨てる。 -20℃で15 mlチューブとストア内のアリコート血清サンプル。 注：また、市販の熱不活化正常ヒトAB血清を使用することができる。 単球の単離2。 遠心機のバランスを容易にするために、並列の2つの軟膜を処理することが推奨される。しかし、CAを取る細胞を混合するために、各ドナーに対して個別の材料を使用していないために再。場合にバフィーコートを容易に得ることができない、ヘパリン処理末梢血400mlの代わりに使用することができる。 慎重に軟膜を含むプラスチック袋を消毒し、2 50mlチューブに各軟膜の内容を転送します。 各軟膜のために15ミリリットルのフィコール溶液（1.077グラム/ ml）で3 50mlチューブを埋める。フィコール、準備のために室温であるべきである。 最初の密度勾配のためのフィコール溶液上にバフィーコート血液30〜35ミリリットル層。両方の層を混合を防止するために、ゆっくりと慎重にこれを行うように注意してください。 室温で30分間ブレーキなしで400×gで遠心分離する。 各勾配を50 mlチューブにプラスチック製パスツールピペットと転送との二つの相の間に位置している末梢血単核細胞（PBMC）の白色リングを収集する。 全部で40ミリリットルまでのPBS-EDTA（1mM）をそれぞれのチューブを埋める。 室温でブレーキなしで10分間、300×gで遠心分離する。 上清を吸引し、40mlのPBS-EDTA（1mM）を、再度ペレットを洗浄。 各ドナープールのために、フェノール10 +赤％のFCSを含まない20ミリリットルRPMI-1640中のペレット。 第二密度勾配のための等浸透圧パーコール溶液を調製する：1.87ミリリットル10倍PBSで50mlチューブに2つのドナーは23.13ミリリットルパーコール溶液（1.131グラム/ mlの密度）を混ぜてください。次に、新しい50mlチューブに、この溶液を23​​mlの転送および46％の等張パーコール溶液を得+フェノールレッド10％FCSで27ミリリットルRPMI-1640を追加する。パーコールは、準備のために室温であるべきである。 50mlのチューブに準備されたパーコール溶液25ml各ドナー転送用およびパーコール液の上に2.9で調製したPBMC溶液）層。非常にゆっくりとこれを実行するように注意してくださいdは慎重に、両方の層は簡単に混合する傾向がある。正しく行われた場合、二相が原因の色での差に区別することができる。 室温で30分間ブレーキなしで550×gで遠心分離する。 各勾配のためにプラスチック製パスツールピペットおよび50 mlチューブに移して2段階の間に配置されている単球の白い輪を収集します。 合計で50ミリリットルまでのPBS-EDTA（1mM）をそれぞれのチューブを埋める。 室温でブレーキなしで10分間、400×gで遠心分離する。 上清を吸引し、フェノール10 +赤％FCSで20ミリリットルRPMI-1640でペレットを懸濁します。 マクロファージへの単球の分化3。 パンブルーでの1:10希釈で孤立した単球の数を決定します。単球である大規模な、しばしば不規則な形の細胞を、のみをカウントします。リンパ球である小さく、丸い形の細胞をカウントしないでください。 NOTE：単球数は、彼らが唯一（大小）、FEPテフロンコーティングされたバッグは、細胞の分化のために使用されなければならないどのように多く、どの程度ヒントを与えるので、あまりにも正確に決定する必要はありません。 一人のドナーからの1.0〜1.5×10 8単球、大FEPテフロンコーティング細胞培養バッグ中の細胞を播種。各バッグについては174ミリリットルRPMI-1640、2％ヒトAB血清（セクション1で調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 / mlのM-CSF（180 mlの総容積）からなる培地を調製。 一人のドナーからの3.0〜5.0×10 7の単球については、小さなテフロン被覆細胞培養バッグ中の細胞を播種する。各バッグについては28.5ミリリットルRPMI-1640、2％ヒトAB血清（セクション1で調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 / mlのM-CSF（30 mlの総容積）からなる培地を調製する。 注： たとえば 、8.0×10 7の単球が得られた場合、当社はTWでそれらをシードすることをお勧め4.0×10 7個の細胞それぞれにOより少ない容量のバッグ。代わりにM-CSFの単球は、代替的に、同じ濃度（2.5 ng / mL）を少なくとも顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）と区別することができる。 準備された媒体に細胞懸濁液（20ml）に加え、慎重に混合します。二つの袋は、一人のドナーから調製される場合、細胞懸濁液に20ミリリットルRPMI-1640を追加し、各培地調製する懸濁液の半分を加える。 オプション：単球調製物が無菌のままでいる場合に、血液寒天プレート上の細胞懸濁液の一滴を引き裂き、37℃で一晩インキュベートするかを決定する。 FEPテフロンコーティングされた細胞培養バッグのプラグに50ミリリットルperfusorシリンジのシースを締めて、調製した細胞懸濁液でそれを埋める。 注射器のプラグを抜き、袋から残りの空気を押し出す。閉会コーンと袋を閉じます。 37で6-7日間、袋をインキュベート76; C、5％CO 2。 4。マクロファージ収穫 （最大3時間のインキュベーションが可能です）細胞の剥離を容易にするために、少なくとも1時間氷上で差別化マクロファージとのFEPテフロンコーティングされた細胞培養バッグを置きます。バッグの表面全体が氷で覆われていることを確認してください。 机/ボードの端に最小の圧力の10倍とバッグを引き出します。 慎重にバッグの外側を消毒および閉鎖コーンを取り外します。 、袋のプラグの50ミリリットルの注射器を締め細胞懸濁液を除去し、50mlチューブに移す。 細胞をスピンダウンする、室温で10分間、400×gで遠心分離する。 上清を吸引し、合計で10ミリリットルのRPMI-1640 + 10％FCS中で1袋からのペレットをプール。 血球計で細胞数を決定します（1：4-1：パンブルーでは10倍希釈）。大きな丸い細胞のみをカウントします。注：FEPテフロンコーティングされた袋にマクロファージを分化した後に、ドナーに単球の分離の品質に応じて、残留細胞例えばリンパ球が存在し得る。 FEPテフロンコーティングされた袋を再利用するには、残留細胞を除去するために70％エタノールで2回、それらを洗ってください。 50ミリリットルの70％エタノールでそれらを記入し、一晩インキュベートする。バッグは、滅菌PBSで3倍の滅菌紙でラップし、標準的な手順を用いてオートクレーブ中で滅菌洗浄する。 注：細胞培養​​バッグは、マクロファージ収量の損失なしに数回再使用することができる。しかし、私たちは彼らがリークし始める前に、10の使用後の袋を捨てることにしました。 RPMI-1640 + 10％FCS中で次の実験培養マクロファージ。低い血清濃度が必要な場合は、1％FCSを含むRPMI-1640中で培養することも可能である。シードと3-4時間細胞をインキュベートする。この期間の後、マクロファージは細胞培養皿の一方の表面に付着することに注意してくださいいずれの混入細胞（ すなわち赤血球、リンパ球、及び樹状細胞）を懸濁液に滞在。非接着細胞を除去し、PBSで少なくとも二回細胞を洗浄する。 さらなる実験のための細胞培養ディッシュから培養マクロファージを切断するには、慎重に表面を、それらを削り取る。あるいは、氷上で20分間皿をインキュベート培地を吸引し、そして1mlの無酵素細胞解離緩衝液を加える。 37℃で5分間インキュベートした後、4ミリリットルのPBSを追加し、少なくとも3分間、上下にピペッティングすることにより細胞を剥離。