Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em> In vitro</em> Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

Determinar el host y características virales que influyen en el VIH-1 patogénesis y progresión de la enfermedad es de suma importancia para el diseño racional de vacunas. La respuesta inmune celular es un componente clave de la respuesta inmune humana a la infección VIH-1. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son necesarios para el control inicial de la viremia aguda, y permiten al ordenador establecer un estado de equilibrio (set point) de la carga viral ^1,2. Experimental agotamiento de estas células efectoras se traduce en la pérdida de control viral ^3,4. A pesar de esto, escapan mutaciones surgen dentro del genoma viral que subvertir reconocimiento de CTL de las células infectadas viralmente ^5-9.

Ciertos alelos HLA se han asociado con cargas virales más bajas y más lenta progresión de la enfermedad, incluido el B * 57, B * 27 B * 81 y ^10-15. Parte de los beneficios de protección de los alelos HLA de clase I se puede atribuir al hecho de que se tengan en regiones funcionalmente limitados del genoma, tales como Gagy seleccionar para mutaciones de escape que disminuyen la capacidad del virus para replicarse in vitro ^16-21. Aunque escape del sistema inmune celular es beneficioso para el virus en el contexto de la selección de HLA de clase I alelo, el efecto de estas mutaciones puede tener consecuencias diferenciales para el huésped tras la transmisión a un individuo HLA no coincidentes ^22,23. Por lo tanto, la comprensión de los efectos de la transmisión mutaciones de escape HLA-asociada a la capacidad de replicación viral será importante para mejorar nuestra comprensión de los principios de VIH-1 patogénesis.

Si bien se ha avanzado mucho para identificar y caracterizar los defectos de la aptitud de mutaciones de escape individuales asociados a una clase de HLA I alelos ^24-29, de origen natural aislados HIV-1 han huellas únicas y complejas de los polimorfismos asociados-HLA, probablemente derivado de la HLA presión inmune mediada de diferentes orígenes immunogenetic ^30. En apanálisis de la mera existencia, Goepfert et al. mostró que una acumulación de mutaciones asociadas a HLA en las secuencias de la mordaza de transmisión derivados de 88 Zambianos infectadas de forma aguda se asoció con una reducción en la carga viral del punto de ajuste ^31. Esto sugirió que la transmisión de mutaciones de escape nocivos, específicamente en Gag, a los destinatarios-HLA no coincidentes proporciona un beneficio clínico, y puede ser debido a la replicación viral atenuada. De cara al futuro, es imprescindible para estudiar cómo las combinaciones de los polimorfismos de la mordaza del complejo dentro de los aislamientos naturales trabajan en conjunto para definir las características del virus de transmisión, tales como la capacidad de replicación, y cómo la replicación temprana podría a su vez afectar el VIH-1 parámetros clínicos y de la última etapa patogénesis.

Brockman et al. Demostró por primera vez un vínculo entre la capacidad de replicación de secuencias-gag pro aislado durante la infección etapa crónica y la carga viral tanto en el subtipo C y las infecciones B32-35. El enfoque experimental se presenta en estos estudios, aunque apropiado para examinar la capacidad de replicación in vitro de secuencias derivadas de individuos con infección crónica, tiene varias advertencias y limitaciones técnicas que hacen que estudian el VIH-1 capacidad replicativa en el subtipo C individuos infectados de forma aguda difícil. Este método se basa en la recombinación de secuencias basadas población amplificados por PCR en el subtipo B NL4-3 provirus, que se deriva en parte de LAV, un laboratorio adaptado stock de virus ^36. Generación de virus se realizó por co-transfección de una línea de células T CEM basada en ³⁷ con amplicones de PCR y se digirió ADN NL4-3 delta pro-gag. Este método requiere la consecuencia de virus durante un período de semanas a meses, potencialmente sesgar la naturaleza del stock de virus recuperado en relación con las cuasiespecies virales in vivo, y por lo tanto alterar la medición de la capacidad de replicación in vitro. Este método is más apropiado para el estudio de los individuos infectados crónicamente, donde se selecciona de manera efectiva para el virus de la más alta capacidad replicativa, y donde la clonación de numerosos diferentes variantes virales a partir de un gran número de individuos infectados crónicamente es bastante mano de obra intensiva y por lo tanto no es factible. Sin embargo, dentro de un individuo infectado de forma aguda, hay generalmente uno y cincuenta y nueve variantes presentes, y eliminando así el riesgo de sesgo de la naturaleza del stock de virus recuperado, a través de presiones de selección in vitro, permite una evaluación más precisa de la capacidad de replicación in vitro. En segundo lugar, este método requiere la recombinación de secuencias gag-pro subtipo C en una columna vertebral derivada subtipo B, y podría introducir sesgos de incompatibilidad columna vertebral en el análisis. Debido a estas limitaciones, un gran número de secuencias deben ser analizados con el fin de superar las posibles sesgos introducidos.

Aquí describimos una apro experimental alternativoach apropiada para el estudio de secuencias derivadas del subtipo C individuos con infección aguda. Utilizamos una estrategia de clonación basada en la enzima de restricción para introducir el gen gag derivado de puntos de tiempo infección aguda de los individuos infectados por VIH-1 subtipo C en la cadena principal proviral subtipo C, MJ4. El uso de MJ4 como una red troncal común en el que para clonar genes gag es crucial para el análisis de subtipo C secuencias derivadas. MJ4 se deriva de un aislado primario ^38, y por lo tanto sería menos probable que introducir un sesgo debido a la incompatibilidad subtipo entre la columna vertebral y el gen gag. Además, el enfoque de la utilización de la clonación restricción basada enzima permite la proviral construye a transfectar directamente en células 293T, y para la recuperación de un virus clonal de stock idéntica a la secuencia gag clonado.

El método presentado a continuación es un método de alto rendimiento para evaluar la capacidad de replicación del subtipo C derivada Gag-MJ4virus quiméricos. La transfección en células 293T es sencillo y recuperación de virus toma sólo tres días. In vitro la capacidad de replicación se ensayó en la misma línea de células T basado CEM-CCR5 creado por Brockman et al. ^37, pero utilizando importantes modificaciones de protocolo necesaria para la replicación exitosa del subtipo C MJ4 virus quiméricos. El uso de una línea de células T apropiada en lugar de PBMC permite un gran número de virus quimérico MJ4 subtipo C de la prueba con alta reproducibilidad del ensayo. Por último, utilizando un ensayo radiomarcado de la transcriptasa inversa para la cuantificación de virus en el sobrenadante es más rentable que el uso de kits de ELISA de p24 disponibles comercialmente. También le da un rango dinámico más alto, lo cual era importante para la detección de los virus de mal y altamente replican dentro del mismo ensayo y para detectar diferencias sutiles en la replicación entre los aislados.

En conclusión, el método que aquí se presenta ha permitidoel estudio en profundidad de la capacidad de replicación de secuencias gag derivados de VIH-1 subtipo C infecta de forma aguda las personas de Zambia, y tal como está escrita, también podría ampliarse para estudiar otro subtipo C poblaciones infectadas. Se observó un alto grado de variación en las capacidades de replicación entre los diferentes aislados de la mordaza. Además, hemos sido capaces de demostrar una asociación estadística entre la capacidad de replicación del Gag transmitida y el punto de ajuste de la carga viral, así como con CD4 + descenso durante un período de tres años ^39. Estos resultados destacan la importancia de estudiar las características virales cómo transmitidos, tales como la capacidad de replicación, interactúan con el sistema inmune del huésped para influir en la patogénesis durante la infección temprana y serán integrales para el desarrollo de intervenciones de vacunas eficaces, así como el tratamiento.