הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em> במבחנה</em> יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

קביעת שני המארח ומאפיינים נגיפיים המשפיעים על הפתוגנזה HIV-1 והתקדמות מחלה היא בעל חשיבות עליונה לעיצוב חיסון רציונלים. התגובה החיסונית התאית היא מרכיב מרכזי של התגובה החיסונית האנושית לזיהום HIV-1. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) נחוצים לשליטה הראשונית של viremia החריף, ולאפשר למארח להקים מדינה יציבה (נקודת סט) עומס נגיפי ^1,2. דלדול ניסיוני של תאי מפעיל אלה גורם לאובדן שליטה הנגיפית ^3,4. למרות זאת, לברוח מוטציות להתעורר בתוך הגנום הנגיפי שלחתור תחת הכרת CTL של תאים נגועים בנגיף ^5-9.

אללים HLA מסוימים נקשרו עם עומס נגיפי נמוך והתקדמות מחלה איטית יותר כולל B * 57, B * 27 וB * 81 ^10-15. חלק מהיתרון המגן שלי אללים כיתת HLA ניתן לייחס לעובדה שהם ממקדים אזורים מוגבלים מבחינה תפקודית של הגנום כגון איסור פרסוםובחר למוטציות בריחה שתקטנה את יכולתו של הנגיף לשכפל במבחנה ^16-21. למרות בריחה מהמערכת החיסונית התאית מועילה לווירוס בהקשר של מעמד HLA הבחירה אני אלל, את ההשפעה של מוטציות אלה עלולות להיות השלכות ההפרש למארח על העברת ^ל22,23 פרט HLA-תואם. לכן, הבנת ההשפעות של מוטציות הבריחה הקשורים HLA מועברים על יכולת שכפול נגיפית תהיה חשובה כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה HIV-1 המוקדמת שלנו.

בעוד הרבה הושג התקדמות לזהות ולאפיין את פגמי הכושר של מוטציות בריחה בודדות הקשורים ספציפי כיתת HLA אני אללים של ^24-29, מתרחשות באופן טבעי HIV-1 מבודד שעקבות ייחודיות ומורכבות של פולימורפיזם הקשורים-HLA, סביר הנובעת מHLA לחץ חיסוני בתיווך של רקעי immunogenetic שונים ^30. בapניתוח revious, Goepfert et al. הראה כי הצטברות של המוטציות הקשורות-HLA ברצפי Gag מועברים נגזרים מ88 Zambians חריפות הנגוע הייתה קשורה לירידה בעומס נגיפי נקודת סט ^{ביום 31 ב.} זה הציע שהשידור של מוטציות בריחה מזיקות, במיוחד בGag, לנמעני HLA-תואם מספק תועלת קלינית, ויכול להיות בגלל נחלש שכפול נגיפי. במבט קדימה, זה הכרחי כדי ללמוד כיצד מורכב שילובים של פולימורפיזם Gag בתוך מבודדים באופן טבעי פועל בתיאום להגדיר מאפיינים של הנגיף מועבר כגון יכולת שכפול, ואיך שכפול מוקדם עשוי בתורו משפיע על HIV-1 פרמטרים קליניים ושלב מאוחר פתוגנזה.

ברוקמן et al. הפגין קשר בין יכולת השכפול של רצפי איסור פרסום-פרו מבודדת במהלך זיהום כרוני במה ועומס נגיפי בשני C תת הסוג B ודלקות ראשון32-35. יש הגישה הניסויית שהוצגה במחקרים אלה, אם כי מתאים לבחינת יכולת שכפול במבחנה של רצפים נגזרים מאנשים נגועים כרוני, כמה אזהרות טכניות ומגבלות ההופכות את לימוד HIV-1 קיבולת replicative בתת הסוג C יחידים בחריפות נגוע קשה. שיטה זו מסתמכת על רקומבינציה של רצפים מוגברים-PCR מבוסס אוכלוסייה לprovirus B NL4-3 תת הסוג, שנגזר בחלקו מLAV, מעבדה מותאמת מניות וירוס ^36. דור וירוס בוצע על ידי שיתוף transfection של קו T-cell מבוסס CEM ³⁷ עם amplicons PCR ומתעכל delta- איסור פרסום-פרו NL4-3 DNA. שיטה זו מחייבת תוצאה של וירוס על פני תקופה של שבועות עד חודשים, שעלול להיות שהטתה את האופי של מניות הווירוס התאוששו ביחס לquasispecies הנגיפי in vivo, ולכן שינוי המדידה שיכולת שכפול במבחנה. אני בשיטה זוזה מתאים יותר ללימוד אנשים נגועים כרוני, שבו בצורה יעילה בוחר לוירוס עם קיבולת replicative הגבוהה ביותר, ושבו שיבוט גרסאות נגיפיות שונות רבות ממספר גדול של אנשים באופן כרוני הנגועים הוא עבודה די אינטנסיבי ולכן לא ריאלי. עם זאת, בתוך פרט בחריפות נגוע, יש בדרך כלל 1:59 גרסאות הנוכחיות, ובכך מבטל את הסיכון של עיקום הטבע של מניות הווירוס התאוששו, דרך לחצי בחירה במבחנה, מאפשר להערכה מדויקת יותר של במבחנה שיכולת שכפול. שנית, שיטה זו דורשת recombining רצפי איסור פרסום-Pro C תת סוג לתוך עמוד השדרה נובעת תת סוג B, ויכולה להציג את ההטיות אי התאמת עמוד השדרה לניתוח. בשל מגבלות אלה, מספר רב של רצפים חייב להיות מנותח על מנת להתגבר על כל הטיות אפשריות הציגו.

כאן אנו מתארים appro הניסיוני חלופיACH המתאים ללימוד רצפים נגזרים מאנשים C תת סוג נגוע בחריפות. אנו משתמשים באסטרטגית שיבוט מבוסס אנזים הגבלה להציג את גן איסור הפרסום נובע מנקודות זמן זיהום חריפות של אנשים נגועים תת סוג HIV-1 C לתוך עמוד השדרה proviral C תת הסוג, MJ4. השימוש בMJ4 כעמוד השדרה נפוצה בה כדי לשכפל גני איסור פרסום הוא קריטי לניתוח רצפים נגזרים תת סוג C. MJ4 נגזר מבודד עיקרי ^38, וכך יהיה פחות סיכוי להציג את ההטיה בשל אי התאמה בין תת עמוד השדרה וגן איסור פרסום. בנוסף, הגישה של שימוש בשיבוט הגבלה מבוססת אנזים מאפשרת לproviral בונה להיות transfected ישירות לתוך תאי 293T, ולהתאוששות של מניות וירוס משובטים הזהה לרצף איסור הפרסום המשובט.

השיטה המובאת להלן היא שיטת תפוקה גבוהה להערכת יכולת השכפול של C תת סוג נגזרה Gag-MJ4וירוסי chimeric. Transfection לתוך תאי 293T הוא פשוט וההתאוששות של וירוס לוקחת רק שלושה ימים. במבחנה יכולת שכפול assayed על הקו זהה CEM-CCR5 מבוסס T-cell שנוצר על ידי et ברוקמן אל. ^37, אבל באמצעות שינויים בפרוטוקול חשובים נחוצים לשכפול המוצלח של וירוסי chimeric תת סוג C MJ4. השימוש בקו T-תא מתאים ולא PBMCs מאפשר למספר גדול של וירוסי MJ4-chimeric C תת הסוג להיבדק עם שחזור הגבוה assay. לבסוף, באמצעות assay טרנסקריפטאז radiolabeled לכימות של וירוס בsupernatant הוא יותר חסכוני מאשר באמצעות ערכות ELISA p24 הזמינים מסחרי. זה גם נותן טווח דינמי גבוהה יותר, מה שהיה חשוב לאיתור שני הווירוסים משכפלים גרוע ומאוד בתוך אותו assay ולאיתור הבדלים דקים בשכפול בין בידודים.

לסיכום, השיטה המוצגת כאן אפשרה להמחקר המעמיק של יכולת השכפול של רצפי איסור פרסום נובעים מתת הסוג HIV-1 C בחריפות אנשים נדבק מזמביה, וכפי שנכתב, יכול גם להיות מורחב כדי ללמוד תת סוג אחר C נגוע אוכלוסיות. רמה גבוהה של שונות ביכולות שכפול בין בידודי Gag השונים נצפתה. בנוסף, הצלחנו להראות קשר סטטיסטי בין יכולת השכפול של Gag המשודר ועומס נגיפי נקודה שנקבעה, כמו גם עם CD4 + ירידה על פני תקופה של שלוש שנות ^39. תוצאות כאלה מדגישות את החשיבות של לימוד מאפיינים נגיפיים איך לשדר, כמו שיכולת שכפול, אינטראקציה עם המערכת החיסונית המארח להשפיע פתוגנזה במהלך הזיהום המוקדם ותהיה נפרד לפיתוח התערבויות חיסון יעילים, כמו גם טיפול.