A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em> In vitro</em> Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

Determinar o host e as características virais que influenciam HIV-1 patogênese e progressão da doença é fundamental para o desenho racional de vacina. A resposta imune celular é um componente chave da resposta imunitária humana a infecção por HIV-1. Os linfócitos T citotóxicos (CTL) são necessários para o controle inicial da viremia aguda, e permitir que o host para estabelecer um estado de equilíbrio (set point) da carga viral ^1,2. Depleção Experimental destas células efectoras resulta na perda de controlo viral ^3,4. Apesar disso, escapar mutações surgem dentro do genoma viral que subverter reconhecimento CTL de células infectadas por vírus ^5-9.

Certos alelos HLA têm sido associados com baixas cargas virais e mais lenta a progressão da doença, incluindo o B * 57, B * 27, B * 81 ^10-15. Parte do benefício de protecção de alelos de HLA de classe I pode ser atribuída ao facto de que eles têm como alvo regiões funcionalmente restritas do genoma, tais como gage seleccionar a presença de mutações de escape que diminuem a capacidade do vírus se replicar in vitro ^16-21. Apesar de fuga do sistema imune celular é benéfica para o vírus no contexto da classe I de HLA de selecção de alelos, o efeito de tais mutações podem ter consequências diferenciais para o hospedeiro durante a transmissão para um indivíduo de HLA desemparelhado ^22,23. Portanto, compreender os efeitos de mutações de escape transmissíveis associadas ao HLA sobre a capacidade de replicação viral será importante para promover nossa compreensão de início de HIV-1 patogênese.

Embora muito progresso tem sido feito para identificar e caracterizar os defeitos da aptidão de mutações de escape individuais associados a HLA de classe específico I alelos ^24-29, que ocorre naturalmente isolados HIV-1 têm pegadas únicas e complexas de polimorfismos HLA-associado, provavelmente decorrente do HLA pressão imune mediada de diferentes origens imunogenéticas ^30. Em apanálise revious, Goepfert et al. mostraram que a acumulação de mutações associados a HLA-nas sequências derivadas de Gag transmitidos 88 zambianos agudamente infectadas foi associada com uma redução no ponto de ajuste da carga viral ^31. Isto sugeriu que a transmissão de mutações de escape nocivos, especificamente em Gag, para os receptores de HLA desemparelhado fornece um benefício clínico, e pode ser atenuada devido à replicação viral. Seguindo em frente, é imperativo para estudar como as combinações de polimorfismos da mordaça complexa dentro isolados que ocorrem naturalmente trabalhar em conjunto para definir as características do vírus transmitido como a capacidade de replicação, e como replicação precoce pode por sua vez afetar HIV-1 e parâmetros clínicos em estágio final patogênese.

Brockman et al. Demonstrou pela primeira vez uma ligação entre a capacidade de replicação seqüências gag-pro do isolado durante a infecção fase crônica e carga viral, tanto subtipo C e infecções B32-35. A abordagem experimental apresentadas nesses estudos, embora adequado para analisar a capacidade de replicação in vitro de sequências derivadas de indivíduos cronicamente infectados, tem algumas ressalvas técnicas e limitações que torna o estudo HIV-1 capacidade de replicação no subtipo C indivíduos infectados de forma aguda difícil. Este método baseia-se na recombinação de seqüências de PCR amplificados com base populacional para o subtipo B NL4-3 pró-vírus, o que derivou em parte de LAV, um laboratório adaptado estoque de vírus ^36. Geração de vírus foi realizada por co-transfecção de uma linha de células T baseia-CEM ³⁷ com amplicões PCR digerido e delta-gag-pro NL4-3 ADN. Este método exige o crescimento de vírus durante um período de semanas a meses, distorcendo potencialmente, a natureza do material de vírus recuperado em relação aos quasiespie viral in vivo, e, portanto, altera a medição da capacidade de replicação in vitro. Este método ié mais adequado para o estudo indivíduos cronicamente infectadas, quando seleciona eficazmente para o vírus com a mais elevada capacidade de replicação, e onde a clonagem numerosas variantes virais diferentes a partir de um grande número de indivíduos cronicamente infectados é bastante trabalhoso e, por conseguinte, não é viável. No entanto, dentro de um indivíduo com infecção aguda, há geralmente 1-2 variantes presente e eliminando assim o risco de distorcer a natureza da ação do vírus recuperado, através in vitro pressões de seleção, permite uma avaliação mais precisa da capacidade de replicação em vitro. Em segundo lugar, este método requer sequências gag-pro subtipo C recombinação em um subtipo B espinha dorsal derivadas, e pode apresentar desvios incompatibilidade backbone para a análise. Devido a essas limitações, um grande número de sequências devem ser analisados ​​a fim de superar quaisquer potenciais vieses introduzidos.

Aqui nós descrevemos um apro experimental alternativaada apropriado para estudar as sequências derivadas do subtipo C indivíduos com infecção aguda. Nós usamos uma estratégia de clonagem com base de enzima de restrição para introduzir o gene gag derivada de pontos agudos tempo infecção de indivíduos infectados pelo HIV-1 do subtipo C no esqueleto proviral subtipo C, MJ4. O uso de MJ4 como uma espinha dorsal comum, no qual para clonar genes gag é crucial para a análise das sequências derivadas do subtipo C. MJ4 é derivado de um isolado primário ^38, e, portanto, seria menos provável a introdução de viés devido ao subtipo incompatibilidade entre o backbone e gene gag. Além disso, a abordagem de clonagem de enzima à base de restrição permite a proviral constrói a ser transfectada directamente em células 293T, e para a recuperação de um estoque de vírus clonal idêntica à sequência gag clonada.

O método apresentado a seguir é um método de alto rendimento para avaliar a capacidade de replicação do subtipo C derivado Gag-MJ4vírus quiméricos. A transfecção para células 293T é simples e recuperação de vírus tem apenas três dias. Em capacidade de replicação in vitro é ensaiada na mesma linha de células T baseia-CEM CCR5 criado por Brockman et al. ^37, mas usando modificações do protocolo importantes necessárias para a replicação de sucesso do subtipo C MJ4 vírus quiméricos. O uso de uma linha de células T apropriado, em vez de PBMC permite um grande número de vírus do subtipo C-MJ4 quimérica para ser testado com o ensaio de alta reprodutibilidade. Finalmente, usando um ensaio de transcriptase reversa radiomarcado para quantificação do vírus no sobrenadante é mais rentável do que usar p24 disponível comercialmente kits ELISA. Ele também dá uma maior amplitude dinâmica, o que foi importante para a detecção de ambos os vírus mal e altamente replicar dentro do mesmo ensaio e para detectar diferenças sutis na replicação entre os isolados.

Em conclusão, o método aqui apresentado tem permitidoo estudo aprofundado da capacidade de replicação das sequências derivadas de gag do HIV-1 subtipo C com infecção aguda indivíduos da Zâmbia, e como está escrito, também poderia ser expandido para estudar outro subtipo C infectados populações. Observou-se um alto grau de variação nas capacidades de replicação entre os diferentes isolados da mordaça. Além disso, fomos capazes de mostrar uma associação estatística entre a capacidade de replicação do Gag transmitida e carga viral do ponto de ajuste, bem como com CD4 + declínio ao longo de um período de três anos ^39. Esses resultados destacam a importância de se estudar as características virais como transmissíveis, como a capacidade de replicação, interagir com o sistema imune do hospedeiro para influenciar patogênese durante a infecção inicial e será fundamental para o desenvolvimento de intervenções vacina eficaz, bem como o tratamento.