Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em> In vitro</em> Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Om zowel de gastheer en virale kenmerken die invloed HIV-1 pathogenese en progressie van het grootste belang voor rationeel vaccinontwerp. De cellulaire immuunreactie is een belangrijk onderdeel van de menselijke immune reactie op HIV-1 infectie. Cytotoxische T lymfocyten (CTL) zijn nodig voor de eerste controle van acute viremie en laat de host een steady state (set point) viral load ^1,2 vestigen. Experimentele depletie van deze effectorcellen leidt tot verlies van virale controle ^3,4. Ondanks dit, ontsnappen mutaties ontstaan ​​binnen het virale genoom dat CTL erkenning van viraal geïnfecteerde cellen ^5-9 ondermijnen.

Bepaalde HLA allelen zijn geassocieerd met lagere virale lading en tragere progressie van de ziekte zoals B * 57 B * 27 B * 81 en ^10-15. Een deel van het beschermende voordeel van HLA klasse I allelen kan worden toegeschreven aan het feit dat ze gericht functioneel beperkte gebieden van het genoom, zoals Gagen selecteren op ontsnappingsmutaties dat het vermogen van het virus om te repliceren in vitro ^16-21 verminderen. Hoewel ontsnapping van het cellulaire immuunsysteem is gunstig voor het virus in de context van de selectie HLA klasse I allel, kan het effect van deze mutaties differentiële gevolgen voor de ontvangende upon overbrenging moet een HLA-mismatch individuele ^22,23. Daarom is het begrijpen van de effecten van de verzonden-HLA geassocieerd escape mutaties op de virale replicatie capaciteit zal belangrijk zijn om ons begrip van vroege HIV-1 pathogenese bevorderen.

Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij de fitness gebreken van afzonderlijke escape mutaties geassocieerd met specifieke HLA klasse I allelen ^24-29 te identificeren en te karakteriseren, natuurlijk voorkomende HIV-1 isolaten zijn unieke en complexe voetafdrukken van HLA-geassocieerde polymorfismen, waarschijnlijk als gevolg van het HLA gemedieerde immuun druk van verschillende immunogenetische achtergronden ^30. In apet bestaan ​​analyse Goepfert et al. blijkt dat een accumulatie van HLA-geassocieerde mutaties in het uitgezonden Gag sequenties afgeleid van 88 acuut geïnfecteerde Zambians werd geassocieerd met een vermindering instelling viral load ^31. Dit suggereerde dat de overdracht van schadelijke ontsnappingsmutaties, specifiek Gag, HLA-mismatch ontvangers verschaft een klinisch voordeel en kan het gevolg zijn van virale replicatie verzwakt. Moving forward, is het noodzakelijk om te bestuderen hoe complexe combinaties van Gag polymorfismen binnen natuurlijk voorkomende isolaten werken in overleg met de kenmerken van de uitgezonden virus zoals replicatie capaciteit, en hoe vroeg replicatie kunnen op hun beurt van invloed op HIV-1 klinische parameters en de late-fase definiëren pathogenese.

Brockman et al. Eerst een verband tussen de replicatie capaciteit van gag-pro sequenties geïsoleerd tijdens de chronische fase infectie en virale lading in zowel subtype C en B-infecties aangetoond32-35. De experimentele benadering gepresenteerd in deze studies, hoewel geschikt voor de behandeling van in vitro replicatie aantal sequenties, verkregen uit chronisch geïnfecteerde individuen, heeft verschillende technische restricties en beperkingen maken het bestuderen van HIV-1 replicatie capaciteit subtype C acuut geïnfecteerde individuen moeilijk. Deze werkwijze berust op de recombinatie van populatiegebaseerde PCR-geamplificeerde sequenties in de subtype B NL4-3 provirus, dat gedeeltelijk afgeleid van LAV, een laboratorium aangepaste virus stock ^36. Virusproductie werd bewerkstelligd door co-transfectie van een CEM-gebaseerde T-cellijn ³⁷ met PCR amplicons en gedigereerd delta gag-pro NL4-3 DNA. Deze methode vereist de uitgroei van virus gedurende weken tot maanden, eventueel vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock betrekking tot de virale quasispecies in vivo, en derhalve het veranderen van de meting van replicatie capaciteit in vitro. Deze methode is meer geschikt voor het bestuderen van chronisch geïnfecteerde individuen, waar het effectief kiest voor virus met de hoogste replicatieve capaciteit, en wanneer kloneren tal verschillende virale varianten van een groot aantal chronisch geïnfecteerde individuen is vrij arbeidsintensief en derhalve nog niet. Echter, in een acuut geïnfecteerde individu er doorgaans 01:59 varianten aanwezig, en zo het risico van vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock elimineren, door in vitro selectie drukken, zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van de in vitro replicatie capaciteit. Tweede methode vereist recombineren subtype C gag-pro-sequenties in een subtype B afgeleide ruggengraat en kan backbone onverenigbaarheid biases in de analyse introduceren. Vanwege deze beperkingen moeten grote aantallen sequenties worden geanalyseerd om mogelijke vertekeningen ingevoerd overwinnen.

Hier beschrijven we een alternatieve experimentele voorkomendach geschikt voor het bestuderen van sequenties afgeleid van subtype C acuut geïnfecteerde individuen. We gebruiken een restrictie-enzym gebaseerde klonering strategie het gag gen afgeleid van acute infectie tijdstippen van HIV-1 subtype C geïnfecteerde individuen in het subtype C provirale backbone, MJ4 voeren. Het gebruik van MJ4 als gemeenschappelijke backbone waarin gag genen kloneren cruciaal voor de analyse van het subtype C afgeleide sequenties. MJ4 is afgeleid van een primair isolaat ^38, en zou dus minder waarschijnlijk vertekening door subtype incompatibiliteit tussen de hoofdketen en gag gen. Bovendien is de benadering van het gebruik van restrictie-enzymen gebaseerde klonering maakt de provirale constructen rechtstreeks in 293T-cellen worden getransfecteerd, en voor het herstel van een klonale virus stock identiek aan de gekloneerde sequentie gag.

De methode hieronder weergegeven is een high throughput methode voor het beoordelen van de replicatie capaciteit van subtype C afgeleid Gag-MJ4chimère virussen. Transfectie in 293T-cellen is eenvoudig en terugwinning van virus duurt slechts drie dagen. In vitro replicatie capaciteit getest op dezelfde CEM-CCR5 gebaseerde T-cellijn door Brockman e.a.. ^37, maar met belangrijke protocol aanpassingen noodzakelijk voor een succesvolle replicatie subtype C MJ4 chimere virussen. Het gebruik van een geschikte T-cellijn plaats PBMC maakt grote aantallen subtype C MJ4-chimere virussen te testen met hoge assay reproduceerbaarheid. Ten slotte, wordt een radioactief reverse transcriptase assay voor het kwantificeren van virus in het supernatant kosteneffectiever dan met commercieel verkrijgbare p24 ELISA kits. Het geeft ook een hoger dynamisch bereik, die belangrijk zijn voor het detecteren zowel slecht en zeer replicerende virussen binnen dezelfde assay en voor het detecteren van subtiele verschillen in replicatie tussen isolaten.

De conclusie is dat de hier gepresenteerde methode toegestaan ​​voorde grondige studie van de replicatie capaciteit van gag sequenties afgeleid van HIV-1 subtype C acuut geïnfecteerde individuen uit Zambia, en zoals geschreven, kan ook worden uitgebreid naar andere subtype C geïnfecteerde populatie te bestuderen. Een hoge mate van variatie in replicatie capaciteit tussen verschillende Gag isolaten waargenomen. Daarnaast konden we een statistisch verband tussen de replicatie capaciteit van het verzonden Gag en setpoint viral load als met CD4 + daling vertonen gedurende een periode van drie jaar ^39. Dergelijke resultaten benadrukken het belang van het bestuderen van hoe doorgelaten virale kenmerken, zoals replicatie capaciteit, interactie met de gastheer immuunsysteem pathogenese beïnvloeden tijdens de vroege infectie en integraal voor het ontwikkelen van effectieve interventies vaccin evenals de behandeling zal zijn.