Рестриктазой основе Клонирование метод оценки<em> В пробирке</em> Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

Определение хоста и вирусные характеристики, которые влияют на ВИЧ-1 патогенез и прогрессирование заболевания имеет первостепенное значение для рационального проектирования вакцины. Клеточный иммунный ответ является ключевым компонентом человеческого иммунного ответа на ВИЧ-1 инфекции. Цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) необходимы для первоначального контроля острой виремии, и позволяют с хозяином, чтобы создать устойчивое состояние (уставка) вирусной нагрузки ^1,2. Экспериментальный истощение этих эффекторных клеток приводит к потере вирусных управления ^3,4. Несмотря на это, избежать мутации возникают в вирусном геноме, что подорвать CTL признание инфицированных вирусом клеток ^5-9.

Некоторые аллели HLA были связаны с более низким уровнем вирусной нагрузки и более медленными прогрессирования заболевания в том числе B * 57, B * 27 и B * 81 ^10-15. Часть защитного благо аллелей HLA класса I может быть связано с тем, что они ориентированы на функционально ограниченных областей генома, такие как Gagи выберите для эвакуации мутаций, которые снижают способность вируса к репликации в пробирке ^16-21. Хотя побег из клеточной иммунной системы полезно для вируса в контексте класса выбора HLA Я аллель, эффект этих мутаций может иметь дифференциальные последствия для хозяина при передаче на HLA-несоответствие индивидуального ^22,23. Таким образом, понимание последствий передаваемых HLA-ассоциированных эвакуации мутаций на вирусной мощностью репликации будет важно углубить наше понимание ранней ВИЧ-1 патогенезе.

Несмотря на значительный прогресс был достигнут, чтобы идентифицировать и охарактеризовать фитнес дефекты отдельных мутаций эвакуации, связанных с конкретной HLA класса I аллелей ^24-29, естественным штаммы ВИЧ-1 были уникальные и сложные следы HLA-ассоциированного полиморфизма, вероятно, возникающие в связи с HLA -опосредованной иммунная давление различных иммуногенетических фоны ^30. В арrevious анализ, Goepfert др. показал, что накопление HLA-ассоциированных мутаций в передаваемых Gag последовательностей, полученных из 88 остро инфицированных Замбии было связано со снижением уставки вирусной нагрузки ^31. Это позволило предположить, что передача вредных мутаций эвакуации, в частности, в Gag, чтобы HLA-получателей несоответствие обеспечивает клинический эффект, и могут быть ослаблены вследствие вирусной репликации. Двигаясь вперед, необходимо изучить, насколько сложным комбинации Gag полиморфизмов в природе изолятов работать согласованно определить характеристики передаваемого вируса, таких как емкости репликации, и как рано репликация может в свою очередь влияет на ВИЧ-1 клинические параметры и поздней стадии Патогенез.

Брокман и др. Впервые показали связь между способностью репликации кляп-про последовательностей, выделенных во время хронической инфекции стадии и вирусной нагрузки в обоих подтипа C и B инфекций32-35. Экспериментальный подход представлены в этих исследованиях, хотя подходящими для изучения возможностей репликации в пробирке последовательностей, полученных из хронически инфицированных лиц, имеет несколько технических предостережений и ограничений, которые делают изучающих ВИЧ-1 репликативной способности в подтипа C остро инфицированных трудно. Этот метод основан на рекомбинации основе население ПЦР-амплифицированных последовательностей в подтипа B NL4-3 провирусом, производного частично от LAV, лаборатория адаптированы вирусов запас ^36. Вирус поколение было достигнуто путем ко-трансфекции с СЕМ на основе линии Т-клеток ³⁷ с ПЦР-ампликонов и расщепляли дельта-GAG-Pro NL4-3 ДНК. Этот метод требует вырост вируса в течение нескольких недель или месяцев, потенциально перекоса природу выделенного вируса складе в отношении вирусных квазивидов в живом организме, и, следовательно, изменения измерение мощности репликации в пробирке. Этот метод яS больше подходит для изучения хронически инфицированных индивидуумов, где он эффективно выбирает на вирус с самой высокой репликативной способности, и где клонирование многочисленные различные вирусные варианты с большим количеством хронически инфицированных лиц довольно трудоемким и, следовательно, не представляется возможным. Тем не менее, в рамках остро инфицированным человеком, там, как правило, 1:59 варианты присутствуют, и, таким образом, устраняя риск перекоса природу восстановленного вируса складе, через в пробирке давлений отбора, позволяет для более точной оценки в пробирке емкостью репликации. Во-вторых, этот метод требует рекомбинации подтип C кляп-про последовательности в подтип B полученной позвоночника, и может ввести магистральных несовместимости предубеждения в анализ. Вследствие этих ограничений, большое количество последовательностей должны быть проанализированы с целью преодоления любых потенциальных предубеждений, введенные.

Здесь мы опишем альтернативный экспериментальный APPROACH подходит для изучения последовательности, полученные из подтипов C остро инфицированных. Мы используем рестрикции стратегию, основанную клонирования ввести ген рвотный полученный из острых моментов времени инфекция ВИЧ-1 подтипа С инфицированных лиц в подтип C провирусного позвоночника, MJ4. Использование MJ4 в качестве общего позвоночника в которой клонировать гены кляп имеет решающее значение для анализа подтипа C полученных последовательностей. MJ4 является производным от первичного изолята ^38, и, таким образом, менее вероятно, чтобы ввести смещение вследствие несовместимости между подтипа позвоночника и рвотным гена. Кроме того, подход с использованием фермента рестрикции на основе клонирование позволяет провирусной конструкции для трансфекции непосредственно в клетки 293Т, и для восстановления клонального вирусного штамма, идентичной последовательности клонированного затычки.

Метод, представленный ниже, является высокая метод пропускная способность для оценки способности репликации подтипа C происходит Gag-MJ4химерные вирусы. Трансфекцию в клетках 293Т является простым и восстановление вируса занимает всего три дня. В пробирке емкость репликации анализируют на той же CEM-CCR5 основе линии Т-клеток, созданной Брокман соавт. ^37, но с использованием важные изменения протокола необходимо для успешного тиражирования из подтипов C MJ4 химерных вирусов. Использование соответствующей линии Т-клеток, а не МНПК позволяет для большого числа подтип С MJ4-химерных вирусов, которые будут протестированы с высокой анализа воспроизводимости. Наконец, с помощью меченого обратной транскриптазы анализа для количественного определения вируса в супернатанте является более экономически эффективным, чем с использованием коммерчески доступного p24 ELISA комплектов. Это также дает более широкий динамический диапазон, который был важен для обнаружения как плохо и очень реплицирующиеся вирусы внутри же анализе и для обнаружения тонкие различия в репликации между изолятов.

В заключение, метод, представленный здесь позволилоуглубленное изучение способности репликации кляп последовательностей, взятых у ВИЧ-1 подтипа C остро инфицированных лиц из Замбии, и как написано, может также быть расширен для изучения другой подтип C зараженный населения. Наблюдался высокая степень изменчивости в емкостях репликации между различными изолятов Gag. Кроме того, мы смогли показать статистическую связь между мощностью репликации передаваемого Gag и установить точки вирусной нагрузки, а также с CD4 + упадка в течение ³⁹ три года. Такие результаты указывают на важность изучения как передаются вирусные характеристики, такие как емкости репликации, взаимодействуют с иммунной системой хозяина влиять патогенеза в начале инфекции и будет неотъемлемой частью для разработки эффективных мер вакцины, а также лечение.