Мышь Hindbrain<em> Экс Vivo</em> Культура учиться на лице миграции Branchiomotor Neuron

1. Дополнительно: Подготовка Affi-гель гепарин бисер (гель бусы) для FBM Пробирной достопримечательности ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка гелевые шарики минимум за 1 день до начала процедуры эксплантов. Промыть 100 мкл гель гепарином шарик суспензии стерильной PBS в течение 20 мин на ролик при комнатной температуре (RT). Пелле бусины в настольную центрифугу течение 5 мин при 13000 х г. Добавить стерильной PBS и повторите процедуру 4x. После последней промывки, удалить PBS и впитывать шарики в небольшом объеме стерильного раствора, содержащего рекомбинантный белок выбора, заботясь, чтобы покрыть шарики с раствором. Этот протокол использует 100 нг / мкл рекомбинантного человеческого VEGF165 в PBS, чтобы воспроизвести ранее опубликованной эксперимент 16. Инкубируйте гель гепарином шарики с рекомбинантного белкового раствора в течение не менее 12 ч и максимум 1 недели на ролик при 4 ° С. 2. Покрытие культуры Insertс Заднего мозга экспланты культивируют на Corning культуры вставляет с размером пор 8 мкм, или эквивалентные вставками. Культура вставки могут быть повторно использованы после завершения протокола, если они промывают дистиллированной водой, стерилизуют этанолом и хранили в 70% этаноле до необходимости. ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в капюшоне потока в стерильных условиях. Подготовка эксплантатов культуральной среды, состоящей из Neurobasal среде с добавлением В27 (20 мкл / мл), глюкоза (6 мг / мл) и пенициллин / стрептомицин (5 мкг / мкл). Wash культура вставляет стерильной PBS в течение 5 мин и сухой в течение 5-10 мин под капотом потока. Положите одну культуру вставку в каждой отдельной скважине 12well пластины. Примечание: вставки, возможно, потребуется небольшой толчок, чтобы плотно в колодец. Покройте культуры вставки с 10-20 мкг / мл мыши ламинином в Neurobasal среды и поместить их в инкубаторе для тканевых культур (37 ° С, 5% СО <sub> 2) в течение 1 часа. Примечание: Покрытие должно осуществляться в день культивирующий в искусственной среде. 3. Рассечение Hindbrains от E11.5 эмбрионов мыши Cull приуроченный беременной женщины мышь с этической точки зрения утвержденной процедурой на эмбриональный день (E) 11,5 и поместить в матку, содержащий эмбрионов в 100 мм пластиковую чашку с ледяной среде L15. ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги рассечение должны выполняться в ледяной L15. Использование рассекает микроскопом и Дюмон часовщик щипцы номер 5, рвать матки мышечной стенки выставить эмбрионов, отпустите каждый эмбрион, разорвать пуповину, и осторожно удалите желточный мешок. С помощью пластмассовой пипетки Пастера с открытия широким отверстием, передать каждый эмбрион в чистую пластиковую чашку с ледяной L15. Использование Дюмон щипцы, обезглавить эмбрион чуть выше передних конечностей. Если эксперимент требует генотипирование эмбрионов, собирать образцы тканей для изоляции геномной ДНК (например, небольшой Piecе желточного мешка или кончика хвоста 16,20). Поверните голову спинной стороной вверх и определить 4-е желудочек, которая покрыта тонким слоем ткани (рис. 2В). Тщательно проколоть roofplate и начинают очистить его каудально вдоль средней линии над задней части заднего мозга и спинного мозга, а рострально над мозга. Задний мозг должен теперь быть подвержены (рис. 2в). Тщательно дразнить от оставшегося головы мезенхиму и любые мозговые оболочки, которые прикреплены к пиальных стороне заднего мозга (рис. 2D). Удалить среднего мозга и ткани спинного мозга, так что задний мозг разворачивается и может лежать ровно в подготовке открытая книга (Рисунок 2E). Использование широким отверстием пластик пипетки Пастера, передать каждый расчлененный заднего мозга к 12-луночный планшет, содержащий ледяной L15 и хранить их на льду, пока все hindbrains не были расчленены. Использование широким отверстием пластик пипетки Пастера, трансфер грехGLE заднего мозга в пустую чашку, держа его открытую подготовку книги, желудочковая стороной вверх, в капле приближенного 100 мкл L15. Трансфер несколько мкл инкубированных гель гепарин бисера к тому же капли. Примечание: Так как размеры бисера являются переменными, целесообразно передать около 10 бусин, а затем выбрать оптимальный размер для трансплантации в заднем мозге. Сделать небольшой разрыв в заднем мозге ткани и тщательно вставить 1-3 гелевые шарики в ткани заднего мозга на уровне r5 / 6, примерно на полпути между средней линии и бокового края заднего мозга, снижение их в ткани так, чтобы шарик находится как раз под заднего мозга поверхности. ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура вскрытия не может занять от 5-20 мин / заднего мозга, в зависимости от опыта, и может растянуться на длительный период, если пометы большие, во всяком случае, hindbrains должно быть в культуре не более 3 ч вскрытия навсегда Результаты. 4. Задний мозгЭксплантата Культура Снять пластину, содержащую культуру вставки из инкубатора, аспирация решение ламинином покрытия. Положите одну культуру вставки в отдельную посуду культуры, наполненной ледяной L15 и, используя широким отверстием пластик пипетки Пастера, передать каждый заднего мозга вентральной стороной вверх на культуры вставки (рис. 2G). Задний мозг должен полностью лежать плашмя на вставки мембраны. Осторожно поднимите культуры вставку из чашки и промокните его несколько раз на бумаге чистой ткани для удаления избытка жидкости. Этот процесс гарантирует, что задний мозг придерживается культуры вставки в плоской, открытой подготовке книги. Если задний мозг сворачивается, ее ткань может необратимо расти вместе. Заполните оригинальный 12-луночный планшет с 500 мкл предварительно нагретой питательных сред и поместите вставку обратно в этот колодезь. Тщательно отрегулируйте громкость с помощью другого 400-600 мкл СМИ просто покрыть задний мозг, гарантируя, что задний мозг не плаваетот мембраны. Если он плывет, вернитесь к шагу 4.4 и повторять, пока задний мозг не остается прикрепленным к мембране. На данном этапе можно добавить биологические ингибиторы, представляющих интерес для СМИ, чтобы изучить их влияние на миграции FBM нейронов. ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантации шарики или введение других методов лечения, рекомендуется поддерживать по крайней мере, 2 ключевых эксплантов в нормальных условиях роста на эксперимент, чтобы убедиться, что эксперимент был создан успешно. Выдержите эксплантов для 24-30 ч в инкубаторе для тканевых культур (37 ° C, 5% СО 2). 5. Wholemount Иммунофлуоресцентное Окрашивание заднего мозга эксплантов Аспирируйте СМИ из каждой лунки, промыть в PBS и исправить в течение 2 часов при 4 ° С при осторожном перемешивании в ледяной 4% формальдегида (свежеприготовленный или только разморозить 4% параформальдегида, растворенного в PBS). Примечание: Не пытайтесь удалить задний мозг из культуральной вставки до фиксациизавершена. Промыть 3 раза ЗФР. Тщательно очистите hindbrains от культуры вставками использованием Дюмон щипцы. Некоторые экспланты трудно слезть, но, как правило, поднимается, слегка надавливая через раз изгнав PBS из пипетки. Перенесите hindbrains до 2,0 мл с круглым дном трубы для иммунофлуоресценции маркировки. Проницаемыми hindbrains в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) в PBS, содержащем 0,1% Тритон-100 (ПБТ) с нежным прокатки. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в PBT, содержащей 10% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой с нежным прокатки. Инкубировать эксплантов с нежным прокатки при 4 ° С в течение 5 дней с первичным антителом, специфичным для Isl1, разбавленного 1:100 в PBT, содержащим 1% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой. Вымойте эксплантов в РТ 4x с PBT в течение 15 мин каждый. Инкубировать эксплантов с нежным прокатки при комнатной температуре в течение 3 часов с флуорофора-конъюгированного козьего антитела против мышиных антител (например, Alexa Fluor 488 козьего антимышь, разводили 1:200) в PBT, содержащим 1% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой. Вымойте экспланты 4x при комнатной температуре с PBT в течение 15 мин каждая с нежным прокатки. Постфиксный эксплантов в 4% формальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре. Покройте стекло с 3 слоями черной изоленты и акциза с помощью скальпеля небольшой квадратной слоистой лентой, чтобы создать карман для эксплантов; альтернативно, использовать депрессия предметное стекло. Установите каждый задний мозг в SlowFade реагента в одном кармане и накройте покровным стеклом, тщательно избегая пузырьков воздуха ловушки и изображения с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы иммуноокрашивания, в гибридизация с рибонуклеотидных, которые признают FBMS (т.е. Isl1 или Phox2b) может быть использован для визуализации FBM нейроны 16,21. Резюме шагов и сроков Временный спаривания, чтобы получить E11.25 беременности: ~ 14 дней Дополнительно: бисера подготовка (Protocoл 1): ~ 2 часа, за день до изоляции эмбриона Подготовка культуры вставки и СМИ (протокол 2): ~ 30 мин, до изоляции эмбрион Изоляция эмбрионов и задний мозг рассечение (шаги 3.1-3.4): ~ 10 мин / эмбрион Hindbrain рассечение (шаги 3.5-3.7): ~ 5-10 мин / заднего мозга Процедура эксплантата (шаги 3,8-3,9): ~ 5-10 мин / заднего мозга Дополнительно: шарик имплантация (шаги 3.10-3.11): ~ 5-10 мин / заднего мозга Эксплантата культура (шаг 4.7): 24 часа в сутки Фиксация для окрашивания антител (шаг 5.1): 2 часа Процедура окраски и обработки изображений (протокол 5): 5 дней