マウス後脳<em>生体外</em>文化顔面Branchiomotorニューロンの移行を研究する

1。オプション：FBMの観光アッセイのためのアフィゲルヘパリンビーズ（ジェルビーズ）を準備注：外植手順を開始する前に、少なくとも1日ゲルビーズを準備します。 室温（RT）にてローラー上で20分間滅菌したPBSで100μlのゲルヘパリンビーズ懸濁液を洗​​浄する。 13,000×gで5分間テーブルトップ遠心機でペレットビーズ。滅菌PBSを追加し、洗浄操作4Xを繰り返します。 最終洗浄後、PBSを除去し、溶液でビーズを被覆するように注意しながら、選択した組換えタンパク質を含有する滅菌溶液を少量のビーズを浸す。このプロトコルは、以前に発表された実験16を再現するために、PBS中に100μl/ NG組換えヒトVEGF 165を使用しています。 4℃でローラー上で12時間の最小値のための組換えタンパク質溶液と1週間、最大でゲルヘパリンビーズをインキュベート 2。カルチャーインサートのコーティングS 後脳の外植片は8μm孔径、または同等のインサートコーニング培養インサート上で培養する。培養インサートは、それらが、蒸留水で洗浄し、エタノールで滅菌し、必要になるまで、70％エタノール中で保存されて設けられ、プロトコルの完了後に再利用することができる。 注：以下の手順は、無菌条件下で流フード中で実施されるべきである。 B27（20μL/ ml）を、グルコース（6ミリグラム/ ml）およびペニシリン/ストレプトマイシン（/μL5μg）を補充した神経基本培地からなる外植片培養培地を準備します。 洗浄文化が流フードの下で5〜10分間、5分間、乾燥のために滅菌PBSで挿入されます。 12wellプレートの個々のウェルに1カルチャーインサートを配置します。注意：インサートがウェルにしっかりとフィットする小型のプッシュが必要な場合があります。 Neurobasal培地中で10〜20μg/ mlのマウスラミニンで挿入し、組織培養インキュベーター（37℃、5％COに配置し培養を覆う<sub> 2）1時間。注：コーティングは、外植の日に行われるべきである。 3。 E11.5マウス胚からHindbrainsの解剖胎生日に倫理的に承認された手順（E）11.5となりまし妊娠雌マウスを淘汰し、氷冷L15培地と100ミリメートルのプラスチック皿に胚を含む子宮を置く。 注：すべての解剖の手順を氷冷L15で実行する必要があります。 解剖顕微鏡を使用し、デュモンの時計職人は、胚を露出させ、子宮の筋肉の壁が破れ各胚を離し、臍帯を切断し、慎重に卵黄嚢を削除、番号5鉗子。 広口径の開口部を有するプラスチック製パスツールピペットを用いて、氷のように冷たいL15できれいなプラスチック皿に各胚を移す。 デュモンの鉗子を使用して、ただ前肢上記の胚を首を切る。実験は胚の遺伝子型判定を必要とする場合は、ゲノムDNAを単離するための組織サンプルを採取（ 例えば 、小PIEC卵黄嚢や尾の先端16,20のE）。 アップヘッド背側の電源を入れ、薄い組織層（ 図2B）で覆われている4 番目の心室を、識別します。慎重にroofplateを貫通し、後部後脳と脊髄の上、および吻側中脳の上に尾側正中線に沿って剥がす始める。後脳になりました（ 図2C）が露出されるべきである。 慎重に残りの頭部間葉と後脳（ 図2D）の軟膜側に接続されているすべての髄膜を離れていじめる。 後脳をフルに発揮するように、中脳と脊髄組織を除去し、開いた本の準備（ 図2E）に平らにすることができます。 ワイドボアプラスチックパスツールピペットを用いて、氷のように冷たいL15を含む12ウェルプレートに各解剖し後脳を転送し、すべてのhindbrainsを解剖されるまで氷上で保管してください。 ワイドボアプラスチックパスツールピペットを用いて、罪を転送空の皿にGLE後脳、おおよそ100μlのL15の液滴中の開いた本の準備、心室側を上にし、それを維持。 同液滴に培養したゲルのヘパリンビーズの数マイクロリットルを移す。注：ビーズのサイズは可変であるので、約10ビーズを転送してから後脳への移植のための最適なサイズを選択することをお勧めします。 後脳組織中の小さな涙を行い、慎重にR5 / 6のレベルで後脳組織の中に1-3ゲルビーズを挿入し、正中線と後脳の側縁間の半分の方法について、そのような組織にそれらを下げるビーズはちょうど後脳の表面の下に配置されている。 注：解剖の手順は、経験に応じて、5から20分/後脳の間で取ることができ、リットルが大きい場合、長期間にわたってストレッチがあり、いずれにしても、hindbrainsは永久になくなっ3時間後に死後よりも文化にする必要があります結果。 4。後脳外植片培養インキュベーターから培養インサートを含むプレートを外し、ラミニンコーティング液を吸引除去する。 氷のように冷たいL15で満たされた別々の培養皿に挿入して、ワイドボアプラスチックパスツールピペットを用いて、カルチャーインサート（ 図2G）に巻き、各後脳腹側を転送一つの文化を置きます。後脳は、挿入膜上で完全に平らになる必要があります。 注意深く皿から培養インサートを持ち上げて過剰の液体を除去するために清浄なティッシュペーパー上で数回軽くたたく。このプロセスは、後脳が平ら、開いた本製剤中のカルチャーインサートに接着することが保証されます。後脳が丸くした場合、その組織は不可逆的に一緒に成長することができる。 培養培地を予め温め500μlのオリジナル12ウェルプレートを満たし、十分に戻って、このへの挿入を置く。慎重に後脳が浮いていないことを保証するだけ後脳をカバーするために、メディアの別の400〜600μLで音量を調節するメンブレンオフ。それが浮く場合は、4.4に進み、後脳が膜に付着したままになるまで繰り返すように戻ります。 この段階では、FBMニューロンの遊走に対する効果を研究するために培地に目的の生物学的阻害剤を添加することができる。 注：ビーズを移植するか、他の治療を投与した場合、それは実験が正常に設定されていることを確認するため、実験ごとに通常の成長条件下で少なくとも2制御外植片を維持することをお勧めします。 組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で24〜30時間、外植片をインキュベートする。 5。後脳外植片のホールマウント免疫蛍光染色を吸引し、各ウェルから培地を、PBSでリンスし、氷冷した4％ホルムアルデヒド（PBS中に溶解し、新たに調製した、または新たに解凍した4％パラホルムアルデヒド）中で穏やかに撹拌しながら4℃で2時間固定する。注意：固定前に培養挿入から後脳を削除しようとしないでください完了しました。 PBSで3回洗浄します。慎重にデュモンの鉗子を用いて培養インサートからhindbrainsの皮をむく。いくつかの外植片が剥離するのが困難であるが、通常、繰り返しピペットからPBSを放出を通して穏やかな圧力を適用することによって持ち上げることができる。 免疫蛍光標識用の2.0ミリリットルの丸底チューブにhindbrainsを転送します。穏やかなローリング、0.1％トリトンX-100（PBT）を含むPBS中で室温（RT）で30分間hindbrainsを透過性。 穏やかなローリング、10％熱不活性化正常ヤギ血清を含有するPBTでRTで1時間インキュベートする。 ISL1に特異的な一次抗体と共に5日間、4℃で穏やかに巻き付き外植片をインキュベートし、1％の熱不活化正常ヤギ血清を含有するPBTで1:100に希釈した。 15分ごとにPBTを用いてRT 4Xで外植片を洗ってください。 フルオロフォア結合ヤギ抗マウス抗体とともに室温で3時間穏やかに巻き付き外植片をインキュベートする（ 例えば、アレクサフルーア488ヤギ抗マウスは、1％の熱不活化正常ヤギ血清を含有するPBTに）1:200に希釈した。 外植片を穏やかローリングで15分間ずつ、PBT、RTで4倍洗う。 Postfixの室温で30分間4％ホルムアルデヒド中で外植片。 外植片のためのポケットを作成するためにメスで黒い絶縁テープおよび物品税の3層の積層テープの小さな正方形で、スライドガラスをカバーする、あるいは、うつ病ガラススライドを使用しています。 1ポケットにのSlowFade試薬中の各後脳をマウントして、慎重にレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してトラップ気泡や画像を避けて、ガラスカバースリップでカバーしています。 NOTE：免疫染色の代替として、FBMS（すなわち、ISL1又はPhox2b）を認識リボプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションFBMニューロン16,21を可視化するために使用することができる。 ステップとタイミングのまとめ 〜14日：E11.25妊娠を取得するために時限交配オプション：ビーズ準備（ProtocoL 1）：〜2時間、胚の分離前日培養インサートとメディア（プロトコル2）を準備します。〜30分前の胚の分離胚の分離と後脳解剖（3.1から3.4ステップ）：〜10分/胚後脳解剖（3.5から3.7ステップ）：〜5月10日分/後脳外植手順（3.8から3.9ステップ）：〜5月10日分/後脳オプション：ビーズ注入（3.10から3.11ステップ）：〜5月10日分/後脳移植片培養（ステップ4.7）：24時間抗体染色のための固定（ステップ5.1）：2時間染色手順およびイメージング（プロトコール5）：5日