Rato rombencéfalo<em> Ex Vivo</em> Cultura para estudar Facial Migração Branchiomotor Neuron

1. Opcional: Prepare Affi-gel heparina Beads (gel de Contas) para FBM Ensaio atração Nota: Preparar grânulos de gel pelo menos 1 dia antes de iniciar o procedimento de explante. Lavar 100 ul da suspensão de esferas de gel de heparina com PBS esterilizado durante 20 min num rolo à temperatura ambiente (RT). Grânulos de pellets em uma centrífuga de topo de mesa durante 5 min a 13.000 x g. Adicionar PBS estéril e repita o procedimento de lavagem de 4x. Após a lavagem final, retirar PBS e embeber os grânulos em um pequeno volume de uma solução estéril contendo a proteína recombinante de escolha, tendo o cuidado de cobrir as pérolas com a solução. Este protocolo utiliza 100 VEGF165 humano recombinante ng / mL em PBS, para reproduzir uma experiência publicada anteriormente 16. Incubar as pérolas de gel de heparina, com a solução de proteína recombinante para um mínimo de 12 horas e um período máximo de 1 semana, de um rolo, a 4 ° C. 2. Revestimento de Cultura Inserts Explantes rombencéfalo são cultivadas em cultura Corning insere com um tamanho de poro de 8 mM, ou inserções equivalentes. Inserções de cultura pode ser reutilizada depois de completado o protocolo, desde que sejam lavados com água destilada, esterilizada com etanol, e armazenada em etanol a 70% até ser necessário. NOTA: As etapas a seguir devem ser realizadas numa câmara de fluxo em condições de esterilidade. Preparar meios de cultura de explante que consiste em meio Neurobasal suplementado com B27 (20 ul / ml), glicose (6 mg / ml) e penicilina / estreptomicina (5 mg / mL). Cultura de lavagem insere com PBS estéril durante 5 minutos e seco durante 5-10 minutos, sob a câmara de fluxo. Coloque uma inserção de cultura em cada poço individual de uma placa 12well. Nota: inserções pode precisar de um pequeno empurrão para se encaixar bem no poço. Cobrir as inserções de cultura com 10-20 ug / ml de laminina rato em meio Neurobasal e colocá-los numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO <sub> 2) durante 1 hora. Nota: revestimento deve ser realizado no dia de explante. 3. Dissecção da Hindbrains de E11.5 embriões de camundongos Cull cronometrado rato fêmea grávida de um procedimento eticamente aprovado no dia embrionário (E) 11,5 e colocar o útero contendo os embriões em um prato de plástico 100 milímetros com meio L15 gelada. NOTA: Todas as etapas de dissecção deve ser realizada em L15 gelada. Usando um microscópio de dissecação e Dumont relojoeiro fórceps número 5, rasgar a parede do músculo uterino para expor os embriões, libertar cada embrião, cortar o cordão umbilical, e cuidadosamente remover o saco vitelino. Utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico, com uma abertura grande calibre, transferir cada embrião para um prato de plástico limpo com L15 gelado. Utilizando uma pinça Dumont, decapitar o embrião logo acima dos membros anteriores. Se a experiência requer genotipagem dos embriões, recolher amostras de tecido para isolamento de ADN genómico (por exemplo, uma pequena piece do saco vitelino ou ponta da cauda 16,20). Vire o lado dorsal da cabeça para cima e identificar o 4 º ventrículo, que é coberto por uma camada de tecido fino (Figura 2B). Perfurar cuidadosamente o roofplate e começam a descascar afastado caudalmente ao longo da linha média sobre o cérebro posterior posterior e da medula espinhal, e rostralmente sobre o mesencéfalo. A parte posterior do cérebro deve agora ser exposto (Figura 2C). Importunar com cuidado todo mesenchyme cabeça restante e qualquer meninges, que são ligados ao lado pial do cérebro posterior (Figura 2D). Remover tecido da medula espinhal e do mesencéfalo para que o cérebro posterior se desenrola e pode ficar na posição horizontal em uma preparação de livro aberto (Figura 2E). Usando uma vasta de Pasteur de plástico pipeta, transferir cada rombencéfalo dissecados para uma placa de 12 poços contendo gelada L15 e armazená-los em gelo até que todos os hindbrains foram dissecados. Usando uma grande calibre Pasteur de plástico pipeta, transferir um pecadogle hindbrain a um prato vazio, mantendo-se uma preparação livro aberto, o lado ventricular-se, em uma gota de aproximadamente 100 l L15. Transferir alguns microlitros de pérolas de gel de heparina incubadas à mesma gota. Nota: Como os tamanhos de contas são variáveis, é aconselhável transferir cerca de 10 contas e, em seguida, escolher um tamanho ideal para o transplante na parte posterior do cérebro. Fazer uma pequena lágrima no tecido do cérebro posterior e inseri cuidadosamente 1-3 contas de gel para o tecido rombencéfalo no nível de R5 / 6, a cerca de meio caminho entre a linha central e a borda lateral da parte posterior do cérebro, reduzindo-os para dentro do tecido de modo que o talão está posicionado logo abaixo da superfície hindbrain. NOTA: O procedimento de dissecção pode levar entre 5-20 min / hindbrain, dependendo da experiência, e pode se estender por um longo período se ninhadas são grandes, em qualquer caso, hindbrains deve estar em cultura não mais do que 3 horas post-mortem para o bem resultados. 4. HindbrainExplante Cultura Remova a placa contendo as inserções de cultura do incubador, aspirar a solução de revestimento de laminina. Coloque uma lâmina de cultura em um prato de cultura separada cheio de gelada L15 e, usando uma grande calibre plástico Pasteur pipeta, transferir cada lado ventral hindbrain cima sobre a inserção da cultura (Figura 2G). O cérebro posterior deve ficar completamente plana na membrana de inserção. Levante cuidadosamente a inserção da cultura do prato e dab-lo várias vezes em um papel absorvente limpo para remover o excesso de líquido. Este processo assegura que a parte posterior do cérebro adere à inserção de cultura em, uma preparação plana livro aberto. Se o cérebro posterior enrola, seu tecido pode irreversivelmente crescer juntos. Preencha o original 12 poços placa com 500 mL meio de cultura pré-aquecido e coloque a pastilha de volta a este bem. Ajustar cuidadosamente o volume com outro 400-600 ul de meios para cobrir apenas a parte posterior do cérebro, assegurando que a parte posterior do cérebro não flutuarfora da membrana. Se ele flutua, volte ao passo 4.4 e repetir até que a parte posterior do cérebro permanece ligado à membrana. Nesta fase, é possível adicionar inibidores biológicos de interesse para a mídia para estudar seu efeito sobre a migração dos neurônios FBM. NOTA: Se a implantação de contas ou administrar outros tratamentos, recomenda-se manter pelo menos dois explantes de controle em condições normais de crescimento por experimento para garantir que o experimento foi criado com sucesso. Incubar explantes de 24-30 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2). 5. Wholemount Immunofluorescent Coloração de rombencéfalo explantes Aspirar o meio de cada poço, enxaguar em PBS e fixar durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave em gelo frio 4% de formaldeído (paraformaldeído a 4% dissolvido em PBS preparado de fresco ou recentemente descongelado). Nota: Não tente remover hindbrain a partir da inserção da cultura antes da fixaçãoestá completo. Lavar 3x com PBS. Retire cuidadosamente as hindbrains das inserções de cultura, utilizando fórceps Dumont. Alguns explantes são difíceis de descascar, mas geralmente pode ser levantado através da aplicação de uma leve pressão através expulsando repetidamente PBS a partir de uma pipeta. Transfira os hindbrains para 2,0 ml tubos de fundo redondo para a rotulagem de imunofluorescência. Permeabilizar hindbrains durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA) em PBS contendo 0,1% Triton X-100 (PBT) com rolamento suave. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente em PBT contendo 10% inactivado por calor soro normal de cabra com rolamento suave. Incubar explantes com rolamento suave a 4 ° C durante 5 dias, com o anticorpo primário específico para ISL1, diluído a 1:100 em PBT contendo 1% de soro normal de cabra inactivado pelo calor. Lave os explantes em RT 4x com PBT durante 15 min cada. Incubar explantes com rolamento suave à temperatura ambiente durante 3 horas com cabra fluoróforo conjugado anticorpo anti-rato (por exemplo, Alexa Fluor 488 cabra antirato, diluída a 1:200) em PBT contendo 1% de soro normal de cabra inactivado pelo calor. Lave os explantes 4x no RT com PBT de 15 min cada um com rolamento suave. Pós-fixarem os explantes em formaldeído a 4% durante 30 min à temperatura ambiente. Cubra uma lâmina de vidro com 3 camadas de fita isolante preta e impostos especiais de consumo com um bisturi um pequeno quadrado da fita em camadas para criar um bolso para os explantes, alternativamente, use uma lâmina de vidro da depressão. Monte cada hindbrain em reagente SlowFade em um bolso e cobrir com uma lamela de vidro, evitando cuidadosamente a bolhas de ar armadilha e imagem usando um microscópio de varredura a laser confocal. NOTA: Como uma alternativa para a imunocoloração, hibridação in situ com ribossondas que reconhecem FBMS (isto é, ISL1 ou PHOX2B) pode ser usado para visualizar os neurónios FBM 16,21. Resumo dos passos e temporização Cronometrado acasalamento obter gravidezes E11.25: ~ 14 dias Opcional: Bead preparação (Protocol 1): ~ 2 horas, no dia antes do isolamento do embrião Prepare inserções de cultura e mídia (Protocolo 2): ~ 30 min, antes do isolamento do embrião Isolamento de embriões e dissecção hindbrain (passos 3,1-3,4): ~ 10 min / embrião Dissecção rombencéfalo (passos 3,5-3,7): ~ 5-10 min / hindbrain Procedimento explante (passos 3,8-3,9): ~ 5-10 min / hindbrain Opcional: implantação talão (passos 3,10-3,11): ~ 5-10 min / hindbrain Cultura explante (passo 4.7): 24 horas Fixação para coloração de anticorpos (passo 5.1): 2 horas Processo de coloração e de imagem (Protocolo 5): 5 dias