עכבר המוח האחורי<em> Ex Vivo</em> תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים
Summary
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של הצינור העצבי, אבל להעביר להגיע למטרות מתאימות. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) הם מודל שימושי ללמוד נדידת נוירונים. פרוטוקול זה מתאר את wholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר עכבר כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את נדידת FBM.
Abstract
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע למטרות מתאימות. פענוח האותות המולקולריים ששיתוף פעולה להנחות את ההעברה עצבית במוח העוברי ולכן חשוב להבין כיצד הרשתות עצביות מורכבות בצורה שמאוחר יותר לתמוך בחיים לאחר לידה. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) במוח האחורי עובר העכבר לעבור מ rhombomere (r) 4 caudally כדי ליצור גרעיני פנים לזווג באזור נגזר-R6 של המוח האחורי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לwholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר העכבר המתאים לחקור את מסלולי איתות המווסתים את נדידת FBM. בשיטה זו, hindbrains של עוברי עכברי E11.5 הם גזורים ותרבותיים בהכנת ספר פתוחה על מוסיף תרבית תאים ל24 שעות. במהלך הזמן הזה, הנוירונים FBM להעביר caudally כלפי R6 והוא יכול להיות חשוף לנוגדנים לחסימת פונקציה וmolecul הקטןes בתקשורת התרבות או חרוזים הפרין עמוס בחלבונים רקומביננטיים לבחון תפקידים לאיתות מסלולים מעורבים בהכוונת נדידת נוירונים.
Introduction
נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע לאזורי היעד מתאימים הנמצאים במרחק גדול. המיקום הנכון של גופי תא עצביים במקומות מתאימים לאורך צירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי של המוח המתפתח הוא חיוני לנכון חיווט, הישרדות, ותפקוד של הנוירונים האלה לאחר שלב נדידת 1-4. בדומה למנגנונים המולקולריים השולטים 5-7 האקסון הדרכה, ערכות קומבינטורית של רמזים אטרקטיביים ודוחה הם חשבו להדריך נוירונים נודדים 1,8. עם זאת, בשל האינטראקציות של סוגי תאים מרובים, אותות השליטה נדידת נוירונים נחקרו פחות נרחבים מאלה מעורבים בהדרכה האקסון, שניתן ללמוד בתא באופן אוטונומי. המוח האחורי הפיתוח של בעלי חוליות כבר בשימוש במספר המחקרים אחרונים כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ותאייםשל נדידת נוירונים, למשל בחומוס, עכבר ודג זברה 1-4,9. איבר זה מכיל מספר סוגים שונים של נוירונים, ובם כמה תתי סוגים של precerebellar והנוירונים מוטוריים 5,7,10,11.
motorneuron המוח האחורי נולד באזור חדרית הקרוב לfloorplate, והם להתמיין תת ספציפיים לפי rhombomere מוצאם 1,12. נוירונים branchiomotor הפנים (FBM) נוצרים בrhombomere (r) 4 במוח האחורי ולהרחיב את האקסונים שלהם dorsally דרך נקודת יציאת R4 לקשת branchial השנייה למעצבבים את שרירי הפנים 2,9,13. נוירונים FBM של דג הזברה ועכברים לספק מודלים מצוינים ללמוד את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית בתהליך שהיא דמיינו בקלות, משום שהנוירונים האלה reproducibly translocate somata בתהליך spatiotemporally מוגדר היטב. בעכברים, תאי עצב FBM להעביר CAU הראשוןלהתמזמז דרך R5 ואז שניהם caudally וventrally להגיע המיקום הסופי שלהם בצד pial של המוח האחורי בשטח של R6, שבו הם יוצרים את הגרעינים לזווג של העצב השביעי הגולגולת (VIIn) 10,11,14. בדג הזברה, הנוירונים FBM בתחילה להעביר ventrally ולאחר מכן לשנות כיוון בגבול R4-R5 להמשיך נודדים לכיוון שטח pial באופן laminin תלוי 4,12,15,16. הגירה זו ממשיכה על פני תקופה של מספר ימים בפיתוח ויכולה להיות מחולקת לשלבים של הגירה משיקה והרדיאלי, המאפשרת זיהוי של מולקולות אשר מתווכות שני תהליכים שונים אלה. לעומת זאת, תאי עצב FBM של המוח האחורי חומוס העוברי להישאר בR4 3,13,17-19.
במהלך הנדידה שלהם, ניתן לזהות נוירונים FBM, כמו סוגים אחרים או נוירונים מוטוריים, דרך הביטוי שלהם של איון שעתוק homoeodomain גורם 1 (ISL1) 14. לפיכך, wholמכתים emount immunofluorescence או הכלאה באתר לסמן זה בשלבי התפתחותיים שונים חושף את זרם הנדידה הברור של somata FBM המשתרע מR4 לR6 בדג הזברה או עכבר 4,15,16. יתר על כן, כתבים מהונדסים ניאון כגון ISL1-GFP היו בשימוש ככלים מתאימים כדי להמחיש נודדים נוירונים FBM בדג הזברה 3,17-19. בנוסף להתאמתם להדמיה, חוקרים רבים חקרו את ההגירה של תאי עצב FBM בפיתוח דג הזברה, כי עוברי חיים הנטולים ניתן להשפיע בקלות עם טכניקות השתלת תאים ותרכובות תרופתיים ליישם ישירות את המים באקווריום. לעומת זאת, בעובר עכבר מפתחת סגור ברחם, לא ניתן ההשתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או המינהל של נוגדנים לחסימת פונקציה שאינו עוברים את מחסום השליה. יתר על כן, תרכובות תרופתי ניתנות לאם בהריון עלולות להיות בלתיתופעות לוואי רצויים שיכול לפגוע בעובר באופן עקיף. עקיפת מגבלה זו, פיתחנו שיטת vivo לשעבר תרבות למוח האחורי של עכבר כולו, כי הוא תואם עם הגירת נוירון FBM והישרדות ל24 שעות לאחר explanting 7,16. שיטה זו מאפשרת מניפולציה תרופתית קלה, השתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או מנהל של נוגדנים חוסם את הפונקציה ויכולה גם להיות מותאמת ללימודי ההגירה של תת עצביים אחרים במוח האחורי בשלבי התפתחות שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את תרבות wholemount של hindbrains עכבר E11.5 במערכת transwell ללמוד את ההגירה של תאי עצב FBM. פרוטוקול זה מאפשר למוח האחורי motorneurons עכבר כדי להיות כל הזמן בחיים ונודדים לתקופה של 24 שעות, מה שמאפשר vivo לשעבר מניפולציה. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים ניסיוניים המבקשים לזהות את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית. אילו מבחני הגירה מסורתיים explant חתיכות רקמה עצביות קטנות לתוך מטריצה על מנות תרבות ולאפשר תצפית של נוירונים בודדים כפי שהם מגיבים לגירויים חיצוניים, יתרון עיקרי של assay transwell הוא התאמתה כדי לתפעל נוירונים נודדים בסביבת איבר המארח, ולכן יותר הקשר פיסיולוגי. חשוב מכך, חומרים יכולים להיות מיושמים בקלות למוח האחורי לשעבר explants vivo כדי לבדוק את השפיעו על נדידת נוירונים, עקיפת תופעות לוואי אפשרית הקשורים administeתצלצל חומרים אלה לעכבר בהריון. לבסוף, מודל vivo לשעבר גם מאפשר הבדיקה של חומרים שאינם עוברים את מחסום השליה, כגון נוגדנים לחסימת פונקציה. בשל יתרונות אלו, התרבות לשעבר vivo המוח האחורי מספקת אלטרנטיבה ושיטה משלים לשימוש בעוברי דג הזברה, אשר יכול להיות מטופלים עם מולקולות קטנות מסיסים במים במים באקווריום, או לב electroporation ברחם של מוח העוברי, המחייב את השימוש של מתמחים ציוד וקשה יותר להורים מאשר טכניקת התרבות שמתוארת כאן. יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן הוא רמת המוכנות שלה להשתלת חרוזים טבולים בחלבון רקומביננטי או חומרים כימיים אחרים, ובכך מאפשרת את היישום של שיטה עוברית סטנדרטית שפותחה על לתמרן עובר חומוס למודל של עכברים של נדידת נוירונים. בפרט, לשעבר vivo תרבות המודל ניתן להחיל hindbrains של עכברים מהונדסים גנטי defective במולקולות ספציפיות מעורבות בהעברה עצבית, כגון קולטנים צמיחה או גורם הדרכה, ושילוב עם שתלי חרוז כדי לבדוק אם היענות לליגנד הולכת לאיבוד. בנוסף למניפולציה תרופתית, לשעבר vivo פרוטוקול התרבות יכול גם להיות מותאם לelectroporate וקטורי ביטוי שיכול לתפעל ביטוי של גנים של עניין; השיטות מתאימות לelectroporation בעבר תיארו 22,23. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי להמחיש הגירת נוירון ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות בexplants המוח האחורי מעכברים מהונדסים המכילים נוירונים שכותרתו fluorescently FBM, למשל Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד סוגים אחרים של נוירונים נודדים במוח האחורי, כגון אלה היוצרים את הזית הנחות, אם כי זה ידרוש השימוש בhindbrains בשלבים עובריים מבוגרים ועשוי לדרוש תרבות עד 48 שעה, בהתאם לכדאיות עצבית <em> Vivo לשעבר.
צעדים ופתרון בעיות קריטיים
להצלחתו של פרוטוקול זה, חשוב כי עוברים שנאספו בשלב מוקדם E11.5 היום, קרוב יותר לE11.25, כאשר הגירת נוירון FBM רק התחילה. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כדי לתפוס את העוברים בשלב התפתחותי זה בשל השתנות הזדווגות טבעיות של עכברים, ובהתאם לכך, ייתכן שיש כמה השתנות בהארכה של הגירת FBM בין ניסויים שונים. השתנות בהגירה FBM יכולות להיות גם ציינו אם הניסוי לא הושלם בתוך מסגרת הזמן שהוקצתה, שעות על 3, כפי שניתן לראות באיור 3E. רקמת המוח האחורי מעוברי עכברי E11.25 היא עדינה. כאשר לנתח ולאורך כל הליך explant, חשוב שלא לקרוע את רקמת המוח האחורי באזורים מן R4-R6 שבו נוירונים FBM נמצאים. בשל האופי העדין של הפרטים הקטניםתהליך ection, ובגלל המהירות שבה hindbrains ממוקמות לתוך התרבות משפיעה על תוצאה, ההליך עשוי להימשך כמה פעולות תרגול להורים, בפרט לפני דוגמאות או חומרים כימיים יקרות נמצאות בשימוש. לבסוף, חשוב שרקמת המוח האחורי ממוקמת לתוך תצורת ספר פתוחה על להכניס את התרבות, כי קיפול של רקמת המוח האחורי במהלך התרבות ימנע הגירת FBM רגילה (ראה איור 3F).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי [נ"צ. וCR 092839/Z/10/Z] על ידי ניו פרס החוקר [נ"צ. 095623/Z/11/Z] מאמון Wellcome.
Materials
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12 well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. . The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -. L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
