Maus-Hinterhirn<em> Ex Vivo</em> Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

1. Optional: Bereiten Affi-Gel-Heparin-Beads (Perlen Gel) für FBM Art Assay HINWEIS: Bereiten Gelperlen mindestens 1 Tag vor Beginn der Explantation Verfahren. Waschen 100 ul Gel-Heparin Perlensuspension mit sterilem PBS für 20 min auf einer Walze bei Raumtemperatur (RT). Pellet Kügelchen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 13.000 x g. In sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang 4x. Nach dem letzten Waschen, entfernen PBS und genießen Sie die Perlen in einem kleinen Volumen einer sterilen Lösung, die das rekombinante Protein der Wahl enthält, kümmert sich um die Perlen mit der Lösung abzudecken. Dieses Protokoll verwendet 100 ng / ul rekombinanten humanen VEGF165 in PBS, um eine zuvor veröffentlichte Experiment 16 zu reproduzieren. Die Gel-Heparin-Kügelchen, die mit dem rekombinanten Protein-Lösung für mindestens 12 Stunden und höchstens 1 Woche auf einer Walze Inkubieren bei 4 ° C. 2. Beschichtung von Kultureinsatzs Hinterhirn Explantate werden auf Corning Kultur kultiviert fügt mit einem 8 um Porengröße oder entsprechende Einsätze. Kultureinsätze können nach Abschluss des Protokolls wieder verwendet werden, sofern sie mit destilliertem Wasser gewaschen, mit Ethanol sterilisiert und in 70% Ethanol bis zum Gebrauch gelagert. HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem Strömungshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vorbereitung Explantat Kulturmedien aus Neurobasalmedium mit B27 (20 ul / ml) ergänzt, Glucose (6 mg / ml) und Penicillin / Streptomycin (5 ug / ul). Waschkultur-Inserts mit sterilem PBS für 5 min und trocken für 5-10 min unter der Flow-Haube. Legen Sie ein Kultureinsatz in jede einzelne Vertiefung einer 12well Platte. Hinweis: Einsätze können einen kleinen Push-to-fest in die gut passen müssen. Decken Sie die Kultureinsätze mit 10-20 pg / ml Maus-Laminin in Neurobasalmedium und legen Sie sie in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO <sub> 2) für 1 Stunde. Hinweis: Beschichtung sollte am Tag der Explantation vorgenommen werden. 3. Dissektion der Hindbrains von E11.5 Maus Embryonen Cull zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren an embryonalen Tag (E) 11,5 und legen die Gebärmutter, die die Embryonen in einer 100-mm-Kunststoffschale mit eiskaltem L15 Medium. HINWEIS: Alle Dissektion Schritte müssen in eiskaltem L15 durchgeführt werden. Mit einem Binokular und Dumont Uhrmacherpinzette Nummer 5, reißen die Uterusmuskulatur Wand, um die Embryonen aussetzen, lassen jeden Embryo, die Nabelschnur durchtrennen und entfernen Sie vorsichtig den Dottersack. Mit einem Kunststoff Pasteur-Pipette mit einem Weitbohrungsöffnung, jeder Embryo zu übertragen in eine saubere Plastikschale mit eiskaltem L15. Mit Dumont Pinzetten, enthaupten den Embryo direkt über den Vordergliedmaßen. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln Gewebeproben für die Isolierung genomischer DNA (z. B. eine kleine piece der Dottersack oder Schwanzspitze 16,20). Drehen Sie den Kopf Rückenseite und identifizieren die 4. Herzkammer, die von einer dünnen Gewebeschicht (2B) abgedeckt ist. Sorgfältig durchbohren die roofplate und beginnen, es kaudal entlang der Mittellinie über den hinteren Hinterhirn und Rückenmark abzulösen und rostral über das Mittelhirn. Rautenhirn sollte nun ausgesetzt werden (Fig. 2C). Sorgfältig necken das verbliebene Kopfmesenchyms und keine Hirnhäute, die der Pia-Seite des Hinterhirn (Abbildung 2D) befestigt sind. Entfernen Mittelhirn und Rückenmark, so dass das Hinterhirn entfaltet und flach in einem offenen Buch Vorbereitung (2E) liegen. Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette jede seziert Hinterhirn zu einer 12-Well-Platte mit eiskaltem L15 und speichern sie auf Eis, bis alle hindbrains wurden seziert. Mit einem Weit Bohrung Kunststoff Pasteur Pipette eine Sündegle Hinterhirn in eine leere Schüssel, halten sie ein offenes Buch Vorbereitung, ventrikuläre Seite nach oben in einem Tropfen ca. 100 ul L15. Bringen Sie ein paar Mikroliter der Heparin-Gel inkubiert Perlen auf die gleiche Tröpfchen. Hinweis: Da die Größen der Perlen sind variabel, empfiehlt es sich, rund 10 Perlen Transfer und wählen Sie dann eine optimale Größe für die Transplantation in den Hinterhirn. Machen Sie einen kleinen Riss in der Hinterhirn Gewebe und vorsichtig einführen 1-3 Gel-Kügelchen in der Hinterhirn Gewebe auf der Ebene der r5 / 6, etwa auf halbem Weg zwischen der Mittellinie und der Seitenkante des Hinterhirn, Senken sie in das Gewebe, so dass die Perle wird direkt unter der Oberfläche positioniert Hinterhirn. HINWEIS: Die Dissektion Verfahren kann zwischen 5-20 min / Hinterhirn dauern, je nach Erfahrung und kann sich über einen längeren Zeitraum zu strecken, wenn Würfe groß sind, in jedem Fall, hindbrains sollte in der Kultur nicht länger als 3 Stunden post mortem für das Gute sein Ergebnisse. 4. HinterhirnExplantation Kultur Entfernen Sie die Platte mit den Kultureinsätze aus dem Inkubator, saugen Sie den Laminin-Beschichtungslösung. Legen Sie ein Kultureinsatz in eine separate Kulturschale mit eiskaltem L15 und gefüllt, mit einem breiten Kunststoff-Bohrung Pasteur Pipette jede Hinterhirn Bauchseite nach oben auf der Kultureinsatz (2G). Das Hinterhirn sollte auf den Einsatz Membran vollständig flach liegen. Heben Sie die Kultureinsatz aus der Schüssel und tupfen Sie es mehrmals auf saubere Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dieser Prozess stellt sicher, dass das Hinterhirn hält sich an die Kultureinsatz in einem flachen, offenen Buch Vorbereitung. Wenn das Hinterhirn rollt sich, kann seine Gewebe irreversibel zusammen wachsen. Füllen Sie den ursprünglichen 12-Well-Platte mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedien und setzen Sie den Einsatz wieder in das gut. Die Lautstärke mit einem anderen 400-600 ul Medium, um nur die Hinterhirn decken vorsichtig einstellen, so dass die Hinterhirn nicht schwimmenAus der Membran. Wenn es schwimmt, kehren Sie zu Schritt 4.4 und wiederholen, bis das Hinterhirn bleibt an der Membran angebracht. In diesem Stadium ist es möglich, biologische Inhibitoren von Interesse für die Medien zu ihrer Wirkung auf die Migration von FBM Neuronen zu untersuchen. HINWEIS: Wenn die Implantation Perlen oder anderen Behandlungen verabreicht, ist es empfehlenswert, mindestens zwei Steuer Explantate unter normalen Wachstumsbedingungen pro Experiment, um zu gewährleisten, dass das Experiment wurde erfolgreich eingerichtet. Explantate Inkubation für 24-30 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). 5. Wholemount Immunfluoreszenz-Färbung der Hinterhirn Explantate Saugen Sie das Medium aus jedem Well gründlich in PBS und fixieren für 2 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln in eiskaltem 4% Formaldehyd (frisch zubereitet oder frisch aufgetauten 4% Paraformaldehyd in PBS gelöst). Hinweis: Versuchen Sie nicht, aus dem Hinterhirn Kultureinsatz vor der Fixierung entfernenist abgeschlossen. 3x mit PBS spülen. Die hindbrains Sie vorsichtig von den Kultureinsätze mit Dumont Pinzette. Einige Explantate sind schwer zu schälen, kann aber in der Regel durch sanften Druck durch immer wieder vertreiben PBS aus einer Pipette abgehoben werden. Übertragen Sie die hindbrains bis 2,0-ml-Rundrohre für Immunfluoreszenz-Kennzeichnung. Durchdringbar hindbrains für 30 min bei Raumtemperatur (RT) in PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 (PBT) mit sanften. Inkubation für 1 h bei RT in PBT mit 10% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum mit sanften. Explantate mit sanften Inkubation bei 4 ° C für 5 Tage mit primärer Antikörper, der für ISL1, 1:100 in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum. Waschen Sie die Explantate bei RT 4x mit PBT für 15 min je. Explantate mit sanften Inkubation bei RT für 3 h mit Fluorophor-konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörper (z. B. Alexa Fluor 488 Ziege antiMaus, 1:200 verdünnt) in PBT mit 1% hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum. Waschen Sie die Explantate 4x bei RT mit PBT für 15 min mit je sanften. Postfix die Explantate in 4% Formaldehyd für 30 Minuten bei RT. Decken einen Glasobjektträger mit 3 Lagen schwarzem Isolierband und Verbrauch mit einem Skalpell eine kleine Quadrat der Schichtband, um eine Tasche für den Explantaten zu erstellen, alternativ, verwenden Sie eine Depression Glasträger. Montieren Sie jede Hinterhirn in Slowfade Reagenz in einer Tasche und mit einem Deckglas sorgfältig vermieden, um Lufteinschlüsse und Bild unter Verwendung eines konfokalen Laserrastermikroskop. HINWEIS: Als Alternative zu Immunfärbung in situ Hybridisierung mit Ribosonden, die FBMs (dh Isl1 oder PHOX2B) erkennen kann zum FBM Neuronen 16,21 visualisieren. Zusammenfassung der Schritte und die Zeit Zeitgesteuerte Paarung E11.25 Schwangerschaften zu erhalten: ~ 14 Tage Optional: Bead Vorbereitung (Protocol 1): ~ 2 Stunden, am Tag vor der Embryo Isolation Bereiten Kultureinsätze und Medien (Protokoll 2): ​​~ 30 min, vor dem Embryo Isolation Embryo Isolation und Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,1 bis 3,4): ~ 10 min / Embryo Hinterhirn-Dissektion (Schritte von 3,5 bis 3,7): ~ 5-10 min / Hinterhirn Explantation Verfahren (Schritte von 3,8 bis 3,9): ~ 5-10 min / Hinterhirn Optional: Perle Implantation (Schritte 3,10-3,11): ~ 5-10 min / Hinterhirn Explantatkultur (Schritt 4.7): 24 h Fixierung für Antikörperfärbung (Schritt 5.1): 2 Stunden Färbeverfahren und Bildgebung (Protokoll 5): 5 Tage