Souris Rhombencéphale<em> Ex Vivo</em> Culture pour étudier les migrations visage Branchiomotor Neuron

Une. Facultatif: Préparez Affi-gel perles d'héparine (Perles de gel) pour FBM activité Assay NOTE: Préparer des billes de gel d'au moins 1 jour avant de commencer la procédure d'explantation. Laver 100 ul d'héparine suspension de billes de gel avec du PBS stérile, pendant 20 min sur un rouleau à la température ambiante (RT). perles de granulés dans une centrifugeuse de dessus de table pendant 5 min à 13 000 x g. Ajouter PBS stérile et répéter la procédure de lavage 4x. Après le dernier lavage, éliminer le PBS et laisser tremper les perles dans un petit volume d'une solution stérile contenant la protéine recombinante de choix, en prenant soin de couvrir les perles avec la solution. Ce protocole utilise 100 ng / ul VEGF165 humain recombinant dans du PBS pour reproduire une expérience précédemment publiée 16. Incuber les perles de gel d'héparine avec la solution de protéines recombinantes pour un minimum de 12 heures et un maximum de 1 semaine sur un rouleau à 4 ° C. 2. Revêtement de la Culture Insérers Des explants sont cultivés cerveau postérieur mises en culture sur des inserts Corning avec une taille de pores de 8 pm, ou inserts équivalents. des inserts de culture peuvent être réutilisées après la fin du protocole, à condition qu'ils soient lavés avec de l'eau distillée, stérilisée avec de l'éthanol, et stockés dans 70% d'éthanol jusqu'à ce que nécessaire. REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à flux dans des conditions stériles. Préparer explant milieux de culture consistant en milieu Neurobasal additionné de B27 (20 ul / ml), glucose (6 mg / ml) et de la pénicilline / streptomycine (5 ug / ul). Culture lavage insère avec PBS stérile pendant 5 min et sec pendant 5-10 min sous la hotte à flux. Placez un insert de culture dans chaque puits d'une plaque 12well. Remarque: inserts peuvent avoir besoin d'une petite poussée pour s'adapter étroitement dans le puits. Couvrir les inserts de culture avec 10 à 20 pg / ml de laminine de souris dans du milieu Neurobasal et les placer dans un incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO <sub> 2) pendant 1 heure. Remarque: revêtement doit être effectué le jour de l'explantation. 3. Dissection de Hindbrains de E11.5 embryons de souris Abattre chronométré souris femelle enceinte avec une procédure éthique approuvé le jour embryonnaire (E) de 11,5 et placer l'utérus contenant les embryons dans une boîte en plastique de 100 mm avec support de L15 glacée. NOTE: Toutes les étapes de dissection doivent être effectuées dans glacée L15. En utilisant un microscope à dissection et Dumont horloger forceps numéro 5, déchirer la paroi du muscle utérin pour exposer les embryons, libérer chaque embryon, couper le cordon ombilical, et retirez le sac jaune. Avec une pipette Pasteur en plastique avec une large ouverture de forage, transférer chaque embryon dans un plat en plastique propre avec de la glace-froid L15. En utilisant une pince Dumont, décapiter l'embryon juste au-dessus des pattes avant. Si l'expérience nécessite génotypage des embryons, prélever des échantillons de tissus pour l'isolement de l'ADN génomique (par exemple un petit piece de sac jaune ou bout de la queue 16,20). Tournez la face dorsale de la tête et identifier la 4 e ventricule, qui est couverte par une couche de tissu mince (figure 2B). Percer délicatement la roofplate et de commencer à éplucher loin caudale le long de la ligne médiane sur le cerveau postérieur postérieur et la moelle épinière, et rostralement sur le mésencéphale. Le cerveau postérieur devrait maintenant être exposé (figure 2C). Taquiner soigneusement loin le mésenchyme de la tête restant et des méninges qui sont attachés au côté pial du cerveau postérieur (figure 2D). Retirer le tissu de la moelle épinière et du cerveau moyen afin que le cerveau postérieur se déploie et peut être à plat dans une préparation à livre ouvert (figure 2E). L'utilisation d'un grand diamètre en plastique pipette Pasteur, transférer chaque cerveau postérieur disséqué à une plaque de 12 puits contenant de la glace-froid L15 et de les stocker sur la glace jusqu'à ce que tous hindbrains ont été disséqués. L'utilisation d'un grand diamètre en plastique pipette Pasteur, transférer un péchégle cerveau postérieur à un plat vide, garder une préparation à livre ouvert, côté ventriculaire jusqu'à, dans une gouttelette d'environ 100 pi L15. Transférer quelques microlitres de perles incubées gel d'héparine à la même gouttelette. Remarque: Étant donné que les tailles de perles sont variables, il est conseillé de transférer environ 10 perles, puis choisissez une taille optimale pour la transplantation dans le cerveau postérieur. Faire une petite déchirure dans le tissu du cerveau postérieur et insérer soigneusement 1-3 billes de gel dans le tissu du cerveau postérieur au niveau de r5 / 6, à mi-chemin entre la ligne médiane et le bord latéral du cerveau postérieur, les abaisser dans le tissu de sorte que le bourrelet est positionnée juste en dessous de la surface du cerveau postérieur. NOTE: La procédure de dissection peut prendre entre 5-20 min / cerveau postérieur, selon l'expérience, et peut s'étirer sur une longue période si les portées sont grandes, en tout cas, hindbrains doivent être en culture plus de 3 heures post-mortem pour de bon résultats. 4. RhombencéphaleExplantation Culture Retirer la plaque contenant les inserts de culture à partir de l'incubateur, aspirer la solution de revêtement de la laminine. Placez un insert de culture dans une boîte de culture distincte rempli de glace-froid L15 et, en utilisant un large tunnel plastique pipette Pasteur, transférer chaque face ventrale du cerveau postérieur vers le haut sur ​​l'insert de culture (figure 2G). Le cerveau postérieur doit se trouver entièrement à plat sur la membrane de l'insert. Soulevez délicatement l'insert de la culture de l'antenne et tamponner plusieurs fois sur du papier absorbant propre pour enlever l'excès de liquide. Ce processus garantit que le cerveau postérieur adhère à l'insert de culture, une préparation à livre ouvert plat. Si le cerveau postérieur se recroqueville, son tissu peut irréversible grandir ensemble. Remplir la plaque d'origine de 12 puits avec 500 pi milieux de culture préchauffé et placer l'insert de retour dans ce puits. Réglez soigneusement le volume avec un autre 400-600 ul de médias de couvrir tout le cerveau postérieur, veiller à ce que le cerveau postérieur ne flotte pasau large de la membrane. Si elle flotte, retourner à l'étape 4.4 et répéter jusqu'à ce que le cerveau postérieur reste fixée à la membrane. A ce stade, il est possible d'ajouter des inhibiteurs biologiques d'intérêt pour les médias d'étudier leur effet sur ​​la migration des neurones FBM. NOTE: Si l'implantation des perles ou l'administration d'autres traitements, il est recommandé de maintenir au moins deux explants de contrôle dans des conditions normales de croissance par expérience pour s'assurer que l'expérience a été mise en place avec succès. Incuber 24 à 30 heures pour les explants dans un incubateur de culture de tissu (à 37 ° C, 5% CO 2). 5. Wholemount immunofluorescence de Rhombencéphale explants Aspirer les médias de chaque puits, rincer dans du PBS et fixer pendant 2 h à 4 ° C avec agitation douce dans glacée 4% de formaldéhyde (fraîchement préparée ou fraîchement décongelé paraformaldéhyde 4% dissous dans du PBS). Note: Ne pas essayer d'enlever le cerveau postérieur de l'insert de culture avant la fixationest complète. Rincer 3x avec PBS. Retirer délicatement les hindbrains des inserts de culture à l'aide de forceps Dumont. Certains explants sont difficiles à décoller, mais peuvent généralement être levées en appliquant une pression douce à travers l'expulsion répétée PBS à partir d'une pipette. Transférer les hindbrains à 2,0 ml tubes à fond rond pour marquage en immunofluorescence. Perméabiliser hindbrains pendant 30 min à température ambiante (RT) dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100 (PBT) avec roulement doux. Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans PBT contenant 10% de sérum de chèvre normal inactivé par la chaleur avec roulement doux. Incuber les explants avec roulement doux à 4 ° C pendant 5 jours avec l'anticorps primaire spécifique pour ISL1, dilué à 1:100 dans du PBT contenant 1% de sérum de chèvre normal inactivé à la chaleur. Laver les explants à RT 4x avec PBT pendant 15 min chacun. Incuber explants avec roulement doux à température ambiante pendant 3 h avec un fluorophore conjugué anticorps de chèvre anti-souris (par exemple, Alexa Fluor 488 de chèvre antisouris, dilué à 1:200) dans PBT contenant 1% de sérum de chèvre normal inactivé à la chaleur. Laver les explants 4x à température ambiante avec PBT pendant 15 min chacun avec roulement doux. Postfix les explants dans 4% de formaldéhyde pendant 30 min à température ambiante. Couvrir une lame de verre avec 3 couches de ruban électrique noir et accises avec un scalpel un petit carré de la bande en couches pour créer une poche pour les explants; alternativement, utiliser une lame de verre de dépression. Montez chaque cerveau postérieur dans le réactif SlowFade dans une poche et couvrir avec une lamelle de verre, en évitant soigneusement de bulles d'air de piéger et de l'image en utilisant un microscope confocal à balayage laser. NOTE: Comme alternative à immunologique, hybridation in situ avec des ribosondes qui reconnaissent FBMS (c.-à-Isl1 ou PHOX2B) en peut être utilisé pour visualiser les neurones FBM 16,21. Résumé des étapes et le calendrier ~ 14 jours: accouplement pour obtenir des grossesses E11.25 temporisé Facultatif: Perle préparation (Protocol 1): ~ 2 heures, le jour avant l'isolement de l'embryon Préparer des inserts de culture et des médias (Protocole 2): ~ 30 min, avant l'isolement de l'embryon l'isolement de l'embryon et la dissection du cerveau postérieur (étapes 3.1 à 3.4): ~ 10 min / embryon Dissection du cerveau postérieur (étapes 3.5 à 3.7): ~ 5-10 min / hindbrain procédure d'explantation (étapes 3.8 à 3.9): ~ 5-10 min / hindbrain Facultatif: Perle implantation (étapes 3.10 à 3.11): ~ 5-10 min / hindbrain culture de l'explantation (étape 4.7): 24 h Fixation pour la coloration des anticorps (étape 5.1): 2 heures Procédure de coloration et de l'imagerie (protocole n ° 5): 5 jours