Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

L'attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l'infezione, la malattia, e la vaccinazione ^7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l'antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l'assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l'attivazione di ingenuo CD4 ⁺ e CD8 ⁺ citolitica cellule T ^8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati ​​o ospitano derivata marcatori di stress e danno cellulare. Toll like receptors (TLR) sono recettori di membrana legato pattern recognition che riconoscono certi extracellulare patogeno fagocitato pattern molecolari associati (PAMPs) e modelli molecolari pericolo associato (smorza). Per cenno contrario like receptors (NLRs) sono citosolico e rispondere ad una vasta gamma di PAMPs e smorza. Nod like receptors representare una seconda linea di difesa contro gli agenti patogeni che eludono superficie cellulare e PRRs endocitiche. L'interazione del patogeno derivata o "pericolo" associata, fattori con TLR e NLR ligandi porta ad uno stato di maturazione delle DC conseguente maggiore interazione DC con altre cellule immunitarie e promozione della cellula T e l'attivazione delle cellule natural killer ^11.

L'interleuchina-1β è una componente cruciale della difesa dell'ospite contro le infezioni. All'atto della rilevazione di un microrganismo, la citochina proinfiammatoria molto, IL-1β, è secreta e funziona come un attrattivo chemio e attivatore delle cellule immunitarie innate e adattative. In vivo IL-1β è in gran parte responsabile della risposta di fase acuta tra cui febbre e citochine infiammatorie sintesi ^12.

La maggior parte NLRs contengono un dominio ricco di ripetizione C leucina terminale che è pensato per funzionare in sensing ligando, un nucleotide dominio di legame centrale (NACHT), che è imponella documentazione, per NLRP3 oligomerizzazione, ed un terminale di dominio effettore N (PYD in NLRP3) che media la trasduzione del segnale a bersagli a valle attraverso interazioni proteina proteina. La proteina NLRP3 definisce il complesso più intensamente studiati inflammasome. Questa proteina è un membro della famiglia NLR e ha la capacità di formare un complesso proteico molecolare più composto NLRP3, il PYCARD proteina adattatore (noto anche come ASC), e ICE. Dopo l'attivazione inflammasome PYCARD si lega ai domini terminali NLRP3 N e recluta ICE, attraverso l'attivazione delle caspasi e il dominio di reclutamento (CARD) domini. Interleuchina-1 enzima di conversione viene inizialmente generato come zimogeno contenente un motivo CARD al suo N-terminale. Risultati formazione inflammasome nel portare due molecole ICE sufficientemente vicino per indurre la loro attivazione autocatalitica. Il complesso inflammasome necessari all'attivazione ICE permettendo così di convertire citoplasmatica pro-IL-1β maturare citochina.

La secrezione di successo di IL-1β in DC richiede rilevamento di due segnali di pericolo diversi e indipendenti. Primo, TLR rilevamento di PAMPs, smorza o segnalazione citochine (TNFa o IL-1β) causa un upregulation dell'espressione della proteina pro-IL-1β citoplasmatica. È necessaria una seconda, spesso diversi, segnale per inflammasome formazione del complesso monte di ICE maturazione. Alcuni inflammasome segnali di stimolare includono le tossine membrana batterica formazione di pori (come nigericin), lisosomiali interrompendo cristalli (come ad esempio cristalli di urato monosodico, MSU), e ATP extracellulare. Il meccanismo che porta a monte NLRP3 attivazione inflammasome da questi diversi attivatori è chiaro. Gli studi che indagano monte segnalazione della formazione inflammasome propone di eventi intracellulari, come l'induzione di ipopotassiemia o di specie reattive dell'ossigeno (ROS) indirettamente attivano il inflammasome ^13-28.

Tra i diversi attivatori virali del inflammasome NLRP3 è influenza, che fornisce bOth il segnale primario e secondario richiesto per la secrezione di IL-1β ^{3, 29-33.} Utilizzando modelli NLRP3 topo knockout è stato trovato che la secrezione di IL-1β in DC è NLRP3 dipendente ^32. Inoltre, NLRP3 topi knockout attratti minor numero di leucociti nel sito di infezione e sperimentato una maggiore mortalità ^{2, 5.} Due lavori recenti suggeriscono un meccanismo per l'attivazione inflammasome NLRP3 durante l'infezione da virus influenzale; prima, adescamento attraverso il riconoscimento di RNA virale da TLR7 o TLR8 (seconda espressione TLR della cellula risponde) o tramite rilevamento di batteri commensali da altri TLR per indurre l'espressione citoplasmatica pro-IL-1β, seguito da un secondo segnale, l'attivazione di NLRP3 formazione inflammasome da proteine ​​canale ionico M2 virale sulla rete transeuropea Golgi ^{33, 34.} In quest'ultima fase, l'attivazione del inflammasome NLRP3 è compiuto da disturbi del ionico intracellulare <em> ambiente che porta alla produzione di ROS, che è semplice, rilevata da NLPR3 come segnale per formare il inflammasome. Tuttavia, il meccanismo preciso di inflammasome monte l'attivazione di attività ICE durante l'infezione influenzale rimane ancora poco chiaro.

Questo lavoro descrive una tecnica utile per studiare la inflammasome NLRP3 in moDCs umani che può essere utilizzato come base per ulteriori indagini della via sottostante DC basato secrezione di IL-1β in risposta a TLR8 legatura con R848 seguita dall'attivazione del inflammasome da un pozzo attivatore noto di NLRP3, nigericin. Variazioni di questo metodo possono essere utilizzati con altri tipi di cellule inclusi, ma non limitati a: monociti, macrofagi, altri sottoinsiemi DC e cellule epiteliali.