تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان
Summary
الخلايا الجذعية (DCS) تفرز IL-1β ردا على اعتراف TLR8 من البيورين الاصطناعية، R848، تليها NLRP3 تفعيل inflammasome مع nigericin، وبالتالي، IL-1β يمكن استخدامها لقياس النشاط NLRP3 inflammasome. وتستخدم الخلايا تلطيخ خلوى، immunoblotting، وELISA لقياس بدقة NLRP3 inflammasome فتيلة والتنشيط عبر IL-1β التعبير.
Abstract
العمليات الالتهابية الناجمة عن إفراز الإنترلوكين (IL) -1 السيتوكينات الأسرة من قبل خلايا المناعة يؤدي إلى التهاب المحلية أو النظامية، وإعادة عرض الأنسجة وإصلاحها، ومراقبة فيروسية 1 و 2. انترلوكين 1β عنصرا أساسيا من الاستجابة المناعية الفطرية ويساهم في القضاء على مسببات الأمراض الغازية في حين منع إقامة العدوى المستمرة 1-5.
Inflammasomes هي منصة الإشارات الرئيسية لتفعيل انترلوكين 1 تحويل انزيم (ICE أو كاسباس 1). وinflammasome NLRP3 يتطلب اثنين على الأقل في البلدان النامية إلى إشارات تسبب إفراز IL-1β 6. الموالية للIL-1β البروتين التعبير محدودة في يستريح الخلايا؛ لذا لا بد من الإشارة فتيلة لالنسخ IL-1β والبروتين التعبير. والإشارة الثانية لمست من خلال النتائج NLRP3 في تشكيل البروتين متعددة NLRP3 inflammasome. قدرة الخلايا الجذعية المسؤولة لد للإشارات المطلوبة لإفراز IL-1β يمكن اختبارها باستخدام البيورين الاصطناعية، R848، الذي تشعر به TLR8 في الوحيدات الإنسان مشتق الخلايا الجذعية (moDCs) إلى خلايا رئيس، تليها تفعيل inflammasome NLRP3 مع السم البكتيري و حامل الأيون البوتاسيوم، nigericin.
ويتم إنتاج البلدان النامية الوحيدات المستمدة بسهولة في الثقافة وتوفير أكثر بكثير من الخلايا النقية البلدان النامية النخاعي الإنسان. طريقة المقدمة هنا يختلف عن المقايسات inflammasome الأخرى في أنه يستخدم في المختبر الإنسان، بدلا من الماوس مشتقة، البلدان النامية وبالتالي السماح لدراسة inflammasome في مرض الإنسان والعدوى.
Introduction
مطلوب تفعيل نظام المناعة الفطرية لتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية خلال العدوى والمرض، والتطعيم 7. الخلايا الجذعية هي أقوى مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي الفطري؛ فهي متخصصة لامتصاص المستضدات، والهجرة إلى الغدد الليمفاوية، وتفعيل السذاجة CD4 + CD8 + ولحل الخلايا (خلايا تي) 8-10. لتمكين الكشف الممرض السريع نظام المناعة الفطرية يستخدم العديد من سلالة الجرثومية ترميز مستقبلات التعرف على الأنماط (PRR) التي تعترف الممرض الحفظ الزخارف المستمدة أو المضيف المستمدة من علامات الإجهاد الخلية والضرر. حصيلة مثل مستقبلات (TLRs) هي الغشاء ملزمة مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف بعض الممرض phagocytized خارج الخلية الجزيئية المرتبطة أنماط (PAMPs) والخطر المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). على النقيض من ذلك إيماءة مثل مستقبلات (NLRs) هي عصاري خلوي والرد على مجموعة متنوعة من PAMPs وDAMPs. إيماءة مثل مستقبلات إعادةيقدم خط الدفاع الثاني ضد مسببات الأمراض التي تهرب من سطح الخلية وخنازير التقامي. تفاعل الممرض المشتقة، أو "الخطر" المرتبطة بها، مع عوامل TLR وNLR بروابط يؤدي إلى حالة من النضج العاصمة مما أدى إلى زيادة التفاعل مع DC الخلايا المناعية الأخرى، وتعزيز تي خلية وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية 11.
انترلوكين 1β هو عنصر حاسم في الدفاع المضيف ضد العدوى. عند التحقق من الكائنات الحية الدقيقة، وproinflammatory سايتوكاين للغاية، IL-1β، ويفرز ويعمل بمثابة جاذبة الكيماوي والمنشط للخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. في الجسم الحي IL-1β مسؤولة إلى حد كبير عن استجابة المرحلة الحادة بما في ذلك الحمى والتهاب خلوى التوليف 12.
معظم NLRs تحتوي على C محطة يسين الغنية تكرار المجال الذي يعتقد أن تعمل في مجال الاستشعار يجند، وهو المجال النوكليوتيدات ملزم المركزية (NACHT) وهذا هو IMPOrtant لNLRP3 oligomerization، وN محطة مجال المستجيب (PYD في NLRP3) التي تتوسط نقل الإشارة إلى أهداف المصب من خلال البروتين البروتين التفاعلات. ويعرف البروتين NLRP3 مجمع inflammasome معظم درس بشكل مكثف. هذا البروتين هو عضو في الأسرة NLR، ولديه القدرة على تشكيل متعددة معقدة البروتين الجزيئي يتألف من NLRP3، وPYCARD البروتين محول (المعروف أيضا باسم ASC)، وICE. عند تفعيل inflammasome PYCARD بربط NLRP3 N المجالات محطة وتجند ICE عبر تفعيل كاسباس والمجال التوظيف (CARD) المجالات. يتم إنشاء انترلوكين 1 تحويل انزيم في البداية باعتبارها زايموجين تحتوي على بطاقة عزر في دورته N-محطة. نتائج تشكيل Inflammasome في جلب اثنين من جزيئات ICE بما فيه الكفاية وثيقة للحث على تنشيط ذاتي التحفيز. مجمع inflammasome هو ضروري لتفعيل ICE الأمر الذي يتيح لها تحويل حشوية الموالية للIL-1β إلى أن تنضج خلوى.
إفراز الناجح لIL-1β في البلدان النامية يتطلب الاستشعار عن اثنين مختلفة ومستقلة إشارات الخطر. الأولى، TLR الاستشعار من PAMPs، DAMPs، أو إشارات خلوى (TNFα أو IL-1β) يؤدي إلى upregulation من حشوية الموالية للIL-1β التعبير البروتين. مطلوب الثاني، غالبا ما تكون مختلفة، إشارة لتشكيل مجمع inflammasome المنبع من ICE النضج. وهناك عدد قليل inflammasome تحفيز الإشارات تشمل البكتيريا المسام غشاء تشكيل السموم (مثل nigericin)، الليزوزومية تعطيل البلورات (مثل بلورات أحادية الصوديوم راتي، جامعة ولاية ميشيغان)، وATP خارج الخلية. آلية المنبع مما يؤدي إلى تفعيل NLRP3 inflammasome بهذه تفعيل متنوعة غير واضح. دراسات التحقيق يشير المنبع من تشكيل inflammasome يقترح أن الأحداث داخل الخلايا، مثل تحريض نقص بوتاسيوم الدم أو أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) تنشيط بشكل غير مباشر inflammasome 13-28.
بين تفعيل الفيروسية مختلفة من inflammasome NLRP3 هي إنفلونزا، التي تنص بأوراسكوم تليكوم القابضة إشارة الابتدائية والثانوية المطلوبة لإفراز IL-1β 3، 29-33. باستخدام الماوس نماذج NLRP3 خروج المغلوب تبين أن إفراز IL-1β في البلدان النامية هو NLRP3 تعتمد 32. بالإضافة إلى ذلك، جذبت NLRP3 الفئران خروج المغلوب أقل الكريات البيض إلى موقع الإصابة وشهدت أعلى معدل وفيات 2، 5. وتشير ورقتي الأخيرة آلية لتفعيل NLRP3 inflammasome خلال عدوى فيروس الأنفلونزا؛ أولا، من خلال الاعتراف فتيلة من الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة TLR7 أو TLR8 (اعتمادا على TLR التعبير عن الخلية الاستجابة) أو من خلال الاستشعار من البكتيريا المتعايشة قبل غيرها TLRs للحث على حشوية التعبير الموالية للIL-1β، تليها الإشارة الثانية، وتفعيل NLRP3 تشكيل inflammasome بواسطة البروتين الفيروسي القناة الايونية M2 على شبكة جولجي عبر 33، 34. في الخطوة الأخيرة، مما اثار من inflammasome NLRP3 يتم تحقيق ذلك من خلال اضطراب في الخلايا الأيونية <م> الوسط مما يؤدي إلى إنتاج ريوس، الذي هو، ببساطة، تشعر به NLPR3 كإشارة لتشكيل inflammasome. ومع ذلك، فإن آلية دقيقة من inflammasome المنبع تفعيل النشاط ICE خلال العدوى بالأنفلونزا لا يزال غير واضح.
يصف هذا العمل تقنية قيمة لدراسة inflammasome NLRP3 في moDCs الإنسان التي يمكن استخدامها كأساس لإجراء مزيد من التحقيق في مسار الكامنة DC-تستند إفراز IL 1β استجابة لTLR8 ربط مع R848 تليها تفعيل inflammasome بواسطة بئر المنشط المعروف من NLRP3، nigericin. أشكال مختلفة من هذه الطريقة يمكن استخدامها مع أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: حيدات، الضامة، DC مجموعات فرعية أخرى، والخلايا الظهارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
السيتوكينات الالتهابية هي جزء لا يتجزأ في توجيه الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية لمكافحة العدوى الفيروسية. وقد تبين يفرز IL-1β للزيادة خلال عدوى الأنفلونزا 3، 43، 44. ليست مفهومة تماما الآليات الدقيقة التي يتم من خلالها معالجة هذه السيتوكينات ردا على اعتراف ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه اوليفييه Manches، دكتوراه، دافور Frleta، دكتوراه، وميغان أوبراين، العضو المنتدب لدعمهم وردود الفعل. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وأنجزت بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح روث L. كيرشتاين خدمة أبحاث الجوائز الوطنية للفردي دكتوراه مسبقا الزمالات (F31) لتشجيع التنوع في مجال البحوث الصحية ذات الصلة (AI089030) وRO1 (AI081848 ).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O’Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
