Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Activering van aangeboren immuunsysteem moet adaptieve immuunreacties sturen tijdens infectie, ziekte en vaccinatie ^7. Dendritische cellen zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem; Zij zijn gespecialiseerd voor de opname van antigenen, migratie naar lymfeklieren en activatie van naïeve CD4 ⁺ en CD8 ⁺ cytolytische T-cellen ^8-10. Om een ​​snelle detectie van pathogenen in staat het aangeboren immuunsysteem maakt gebruik van tal van kiembaan gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRR) dat geconserveerde pathogeen afgeleide motieven of gastheer afgeleide markers van cel stress en schade te herkennen. Toll like receptoren (TLR's) zijn membraangebonden patroonherkenning receptoren die bepaalde extracellulaire phagocytized pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en gevaar geassocieerde moleculaire patronen (dempt) herkennen. Daarentegen knipoog like receptoren (NLRs) zijn cytosolische en reageren op een breed scala van PAMPs en DAMPs. Knikken like receptoren opnieuwpresenteren een tweede verdedigingslinie tegen pathogenen die celoppervlak en endocytische PRRs ontwijken. De interactie van pathogeen afgeleide of "gevaar" verbonden factoren TLR-liganden en NLR leidt tot een toestand van DC rijping leidt tot een verhoogde DC interactie met andere cellen en stimulering van T-cellen en natuurlijke killer cel activatie ^11.

Interleukine-1β is een cruciaal onderdeel van de afweer tegen infecties. Bij herkenning van een micro-organisme, de zeer pro-inflammatoire cytokine IL-1β, wordt uitgescheiden en functioneert als een chemo attractant en activator van aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen. In vivo IL-1β is grotendeels verantwoordelijk voor de acute fase respons waaronder koorts en inflammatoire cytokine synthese ^12.

De meeste NLRs bevatten C-terminale leucine rich repeat domein waarvan wordt gedacht dat functioneert ligand detectie, een centrale nucleotide bindend domein (NACHT) die important voor NLRP3 oligomerization, en een N-klem effector domein (PYD in NLRP3) dat signaaltransductie bemiddelt naar stroomafwaartse doelwitten via eiwit-eiwit interacties. De NLRP3 eiwit bepaalt de meest intensief bestudeerde inflammasome complex. Dit eiwit is een lid van de familie NLR en heeft de mogelijkheid om een ​​multi moleculaire eiwitcomplex samengesteld NLRP3, de adaptor eiwit PYCARD (ook bekend als ASC) en ICE vormen. Bij inflammasoom activering PYCARD bindt aan NLRP3 N terminale domeinen en werft ICE via caspaseactivering en werving domein (CARD) domeinen. Interleukine-1 omzettend enzym wordt aanvankelijk geproduceerd als een zymogeen dat een CARD motief aan zijn N-terminus. Inflammasoom formatie resultaten in het brengen van twee ICE moleculen dicht genoeg bij hun autokatalytisch activering induceren. Inflammasome complex is noodzakelijk voor het activeren ICE waardoor deze cytoplasmatische pro-IL-1β omzetten cytokine rijpen.

Succesvolle secretie van IL-1β in DCs vereist sensing van twee verschillende en onafhankelijke gevaar signalen. Eerste, TLR sensing van PAMPs, DAMPs of cytokine signaling (TNF of IL-1β) veroorzaakt een verhoogde expressie van cytoplasma pro-IL-1β eiwit expressie. Een tweede, vaak verschillend, signaal nodig inflammasome complexvorming vóór ICE rijping. Enkele inflammasoom stimulerende signalen omvatten bacteriële porie vormende toxinen (zoals nigericine), lysosomale verstoren kristallen (zoals monosodium uraat kristallen, MSU) en extracellulair ATP. De upstream-mechanisme dat leidt tot inflammasome activering NLRP3 door deze diverse activatoren is onduidelijk. Onderzoeken naar signalering stroomopwaarts van inflammasome formatie stelt dat intracellulaire gebeurtenissen, zoals inductie van hypokaliëmie of reactive oxygen species (ROS) indirect activeren inflammasome ^13-28.

Onder de verschillende virale activatoren van de NLRP3 inflammasome is influenza, waarbij b voorzietOTH de primaire en secundaire signaal dat nodig is voor IL-1β secretie ^{3, 29-33.} Gebruik makend van muis NLRP3 knockout modellen werd gevonden dat IL-1β secretie DCs NLRP3 afhankelijk ^32. Bovendien NLRP3 knockout muizen minder aangetrokken leukocyten naar de plaats van infectie en ervaren hogere mortaliteit ^{2, 5.} Twee recente papers suggereren een mechanisme voor NLRP3 inflammasome activatie tijdens Influenza virus infectie; eerste, priming door herkenning van viraal RNA door TLR7 en TLR8 (afhankelijk TLR expressie van de reagerende cel) of door detectie van commensale bacteriën door andere TLRs cytoplasmatische pro-IL-1β expressie te induceren, gevolgd door een tweede signaal, activering van NLRP3 inflammasoom vorming door virale ionkanaal eiwit M2 op het trans Golgi netwerk ^{33, 34.} In de laatste stap, activering van de NLRP3 inflammasome wordt bewerkstelligd door verstoring van de intracellulaire ionische <em> milieu leidt tot ROS productie, die eenvoudig, gedetecteerd door NLPR3 als signaal naar de inflammasome vormen. De precieze mechanisme van activatie inflammasome stroomopwaarts van ICE activiteit gedurende Influenza infectie nog steeds onduidelijk.

Dit werk beschrijft een techniek voor het bestuderen van de waardevolle NLRP3 inflammasome in menselijke moDCs die kan worden gebruikt als een basis voor verder onderzoek van de pathway DC gebaseerd IL-1β secretie in reactie op TLR8 ligatie met R848 gevolgd door activering van de inflammasome door een goed bekende activator van NLRP3, nigericine. Variaties van deze werkwijze kan worden gebruikt met andere celtypen waaronder, maar niet beperkt tot: monocyten, macrofagen, andere DC subsets en epitheelcellen.