Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems ist erforderlich, um adaptive Immunantwort während der Infektion, Krankheit und Impfung ⁷ lenken. Dendritische Zellen sind die wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems; sie für die Aufnahme von Antigenen, die Migration in die Lymphknoten und die Aktivierung von naiven CD4 ⁺ und CD8 ^{+-cytolytischen} T-Zellen ^8-10 spezialisiert sind. Um eine schnelle Erregernachweis ermöglichen das angeborene Immunsystem nutzt zahlreiche Keimbahn kodiert pattern recognition receptors (PRR), die konservierte Pathogen abgeleiteten Motive oder Wirt stammt Marker der Zellstress und Schäden zu erkennen. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind Membran-gebundene Mustererkennungsrezeptoren, die bestimmte extrazelluläre Erreger phagozytierten associated molecular patterns (PAMPs) und Gefahren associated molecular patterns (gedämpft) zu erkennen. Im Gegensatz Nicken like Rezeptoren (NLR) sind cytosolische und reagieren auf ein breites Spektrum von PAMPs und dämpft. Nod-like-Rezeptoren wiederpräsentieren eine zweite Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, die Zelloberfläche und endozytischen PRRs entziehen. Das Zusammenspiel der Erreger stammt, oder "Gefahr" verbunden sind, Faktoren, die mit TLR-Liganden und NLR führt zu einem Zustand der DC-Reifung zu erhöhten DC Interaktion mit anderen Immunzellen und die Förderung der T-Zell-und Zell-Aktivierung natürlicher Killer ^11.

Interleukin-1β ist ein entscheidender Bestandteil der Immunabwehr gegen Infektionen. Bei Erkennen eines Mikroorganismus, der hoch proinflammatorische Cytokin IL-1β, wird sezerniert und wirkt als ein chemo Lockstoff und Aktivator der angeborenen und erworbenen Immunzellen. In vivo IL-1β ist weitgehend für die Akutphasenreaktion, einschließlich Fieber und inflammatorischen Cytokins verantwortlich ¹² Synthese.

Die meisten NLRs enthalten eine C-terminale Leucin-reichen Repeat-Domäne, das vermutlich in der Ligandenerkennung, einem zentralen Nukleotid-Bindungsdomäne (NACHT), die impo ist funktionierenrtant für NLRP3 Oligomerisierung und einer N-terminalen Effektor-Domäne (PYD in NLRP3), die Signaltransduktion vermittelt den nachgeschalteten Ziele durch Protein-Protein-Interaktionen. Die NLRP3 Protein definiert den am intensivsten untersuchten Inflammasom komplex. Dieses Protein ist ein Mitglied der Familie NLR und hat die Fähigkeit, eine Mehrmolekularproteinkomplex NLRP3, Adaptorproteins PYCARD (auch bekannt als ASC) und ICE zusammen bilden. Nach Aktivierung Inflammasom PYCARD bindet an NLRP3 N-terminalen Domänen und rekrutiert ICE über Caspase-Aktivierung und Rekrutierung Domäne (CARD)-Domänen. Interleukin-1-Converting-Enzym wird anfänglich als ein Zymogen, das eine CARD-Motiv am N-Terminus erzeugt wird. Inflammasom Bildung führt zu bringen zwei ICE-Moleküle nahe genug, um ihre autokatalytische Aktivierung zu induzieren. Das Inflammasom Komplex ist für die Aktivierung ICE so dass es zytoplasmatischen Pro-IL-1β umwandeln Zytokin reifen erforderlich.

Erfolgreiche Sekretion von IL-1β in DCs erfordert Nachweis von zwei verschiedenen und unabhängigen Gefahrensignale. Zunächst TLR Erkundung von PAMPs, dämpft oder Cytokine Signaling (TNF oder IL-1β) bewirkt eine Hochregulation von Zytoplasma-Pro-IL-1β-Protein-Expression. Für Inflammasom Komplexbildung vor der ICE Reifung Eine zweite, oft anders, Signal erforderlich. Ein paar Inflammasom stimulierende Signale sind bakterielle Membran porenbildende Toxine (wie Nigericin), lysosomale stören Kristalle (wie Mononatriumuratkristallen, MSU) und extrazelluläre ATP. Der Upstream-Mechanismus, der zu Inflammasom Aktivierung durch diese unterschiedlichen Aktivatoren NLRP3 ist unklar. Studien, die vor der Signal Inflammasom Bildung schlägt vor, dass die intrazelluläre Ereignisse, wie die Induktion von Hypokaliämie oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die indirekt ^13-28 Inflammasom aktivieren.

Unter den verschiedenen virale Aktivatoren des NLRP3 Inflammasom ist Influenza, die b bietetoth die Primär-und Sekundärsignal für IL-1β Sekretion ^{3, 29-33} erforderlich. Mit der Maus NLRP3 Knockout-Modelle wurde gefunden, dass IL-1β-Sekretion in DCs ist abhängig NLRP3 ^32. Zusätzlich zog NLRP3 Knockout-Mäuse weniger Leukozyten an den Ort der Infektion und erfahrenen höhere Mortalität ^{2, 5.} Zwei neuere Arbeiten legen nahe, einen Mechanismus für die NLRP3 Inflammasom Aktivierung während der Influenza-Virus-Infektion; erste, Grundieren durch Erkennung der viralen RNA durch TLR7 oder TLR8 (abhängig von TLR-Expression der Zelle reagiert) oder durch Erfassung von kommensalen Bakterien von anderen TLR zytoplasmatische Pro-IL-1β-Expression zu induzieren, gefolgt von einem zweiten Signal, die Aktivierung von NLRP3 Inflammasom Bildung durch virale Ionenkanalproteins M2 auf dem trans-Golgi-Netzwerk ^{33, 34.} Im letzten Schritt, die Auslösung des NLRP3 Inflammasom ist durch eine Störung der intrazellulären Ionen erreicht <em> Milieu führt zu ROS-Produktion, das ist einfach, durch NLPR3 als Signal an die Inflammasom bilden erfaßt. Doch der genaue Mechanismus der Aktivierung Inflammasom vor der ICE-Aktivität während der Influenza-Infektion noch unklar.

Diese Arbeit beschreibt eine Technik, wertvoll für das Studium der NLRP3 Inflammasom im menschlichen MoDCs, die als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden Weg DC basierend IL-1β-Sekretion in Reaktion auf TLR8 Ligation mit R848, gefolgt von der Aktivierung des Inflammasom von einem gut genutzt werden kann bekannt Aktivator der NLRP3, Nigericin. Variationen dieses Verfahrens können mit anderen Zelltypen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Monozyten, Makrophagen, anderen DC Untergruppen und Epithelzellen.