JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

Published: June 15, 2014
doi:
10.3791/51219
, ,
1Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Bu protokol, tek bir hücre süspansiyonu için ayrışma olmadan küresel nöral kök ve projenitör hücre agrega genişlemesini sağlayan bir yeni mekanik bir kesme yöntemi tarif etmektedir. Hücre / hücre teması sürdürmek üzerinde 40 geçişleri için hızlı ve istikrarlı bir büyüme sağlar.

Abstract

Araştırma deneyleri ve klinik denemeler için tek bir örnekten hücrelerinin çok sayıda toplamak için bir hücre genişleme tekniği büyük ölçüde kök hücre topluluğuna yarar sağlayacak. Birçok mevcut genişleme yöntemler zahmetli ve masraflı ve tam ayrılma içeren bu birkaç kök ve progenitör hücre tipleri farklılaşmasını ya da erken yaşlanmayı geçmesi neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, basit ve ucuz olan "kesme" olarak adlandırılan bir otomatik mekanik pasajı bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, tek bir hücre içine, kimyasal ya da enzimatik ayrışma önler ve bunun yerine sabit bir hücre / hücre teması muhafaza süspansiyon, küremsi kültürlerin büyük ölçekli bir genişleme sağlar. Doğrama yöntem öncelikle fetal beyin kaynaklı nöral progenitör hücreleri veya neurospheres süredir kullanılan ve son zamanlarda embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreler ile kullanım için yayımlanmıştır. Prosedür involves bir doku kültürü Petri kabı üzerine neurospheres tohumlama ve sonradan etkin elle mekanik olarak her küre Ayrıştırıcı sıkıcı sürecini otomatize hücreleri aracılığıyla keskin, steril bir bıçak geçirerek. Kültür içinde hücreleri süspansiyon uygun bir yüzey alanı-hacim oranı sağlar; 500.000 'den fazla hücre çapı en az 0.5 mm, tek neurosphere içinde yetiştirilebilir gibi. Bir T175 bir şişe içinde, 50000000 fazla hücreleri sadece 15000000 yapışık kültürlerinde göre süspansiyon kültürlerinde büyüyebilir. Önemlisi, kıyma prosedür klinik dereceli hücre ürünlerin kütle miktarı üretimine izin veren, güncel iyi üretim uygulamaları (cGMP) altında kullanılmıştır.

Introduction

Bir tek tabaka 1-3 veya toplam neurospheres 4-7 ya gibi kültür kemirgen sinir kök hücreleri genişleyen uzun bir geçmişi vardır. Buna ek olarak, gelişmekte olan merkezi sinir sisteminin 8-17 çeşitli bölgelerinden izole insan nöral progenitör hücrelerin (hNPCs) in vitro genişletilmiştir. Bu hücreler iki güçlü, astrositlerde ve nöronlar hem de farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve nöral gelişme 18,19 ve hastalık mekanizması 20,21 okuyan çok yararlı bir araç olmuştur. hNPCs ayrıca entegrasyon, hayatta kalma ve fonksiyonel etkileri 22-24 çeşitli düzeylerde ile santral sinir sistemi hastalığı birçok farklı hayvan modellerinde naklediliyor edilmiştir.

Genellikle epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / veya fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2), 25-28 – – ve yapışkan 29 ve hem de üç Geleneksel olarak, kemirgen ya da insan fetal NPC-türevi büyüme faktörleri maruzBoyutlu küremsi sistemleri tipik olarak bir tek hücre süspansiyonu halinde 30-34 enzimatik ayrılma ile pasajlanır. Araştırma ya da klinik kullanım için hücreleri genişletmek için bir standart yöntem kolay manipülasyon nedeniyle yapışkan bir tek tabaka olduğu gibi. Bununla birlikte, enzimatik veya kimyasal çözeltiler ile pasajı tek tabaka ve neurosphere hNPCs erken yaşlanma 35 ile sonuçlandığını göstermiştir. Buna ek olarak, enzimatik ayrışma embriyonik kök hücreler 36-38 ile gösterilen verilere dayalı olarak farklılaşma ve kromozomlarda anormallikleri artan seviyeleri ile sonuçlanabilir. Pasajlanması hNPCs standart yöntem mevcut iyi imalat uygulamaları fazına 1 klinik çalışmalarda (Hücreler Inc, Neuralstem Inc Stem) gitti (cGMP) sınıf ürünler üretti rağmen, yöntem sınırlayıcı, hücre büyütme sadece birkaç mermi izin potansiyeli bankacılık.

Açıkçası, büyük araştırma deneyleri ve gelecekteki klinik denemeleri yeteneği yararlanabilecekbüyük ölçekli büyüme ve hücre bankacılığı izin toplu olarak ve gecikmeli yaşlanması ile hücreleri yaymak. Bu ihtiyacı karşılamak için, hücre-hücre teması korumak için küçük kümeler halinde onları "kesme" bir roman ve mekanik Pasajlanması bozulmamış neurospheres otomatik bir yol geliştirdi. Bu yöntem büyük bir alternatif 3 boyutlu biyoreaktör kültürü yöntemi 40 ile görüldüğü gibi bunların ömrü 39 ve süspansiyon kültürü, tek tabakalı kültürler ile karşılaştırıldığında kuluçka alanı daha verimli kullanımına izin verir artmıştır. Resim kıyma protokol geçişi 10, standart yöntemler kullanılarak bir pasajı olası bir feat daha büyük bir fetal numuneden büyük ölçekli bankaların üretimine olanak sağlamaktadır. Pasajı hNPCs için bu yöntem alışılmamış iken, popülaritesi artmaktadır ve yakın zamanda, bu tür insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde, v dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş ölçekli bir genişleme sağlayan yayınlanmıştıritro hastalık modelleme 41-46. Daha da önemlisi, bir cGMP dereceli hNPC hücre bankası zaten tekniğin gelecekteki klinik uygulamalar karşı uygulanabilir olduğunu gösteren, kesme yöntemi ile üretilmiştir.

Protocol

1.. Etik Beyanı ve Güvenlik Bu prosedür, insanlardan veya hayvanlardan elde edilen hücre kültürü ürünleri kullanımını gerektirir. Türetilen tüm dokular uygun Kurumsal Değerlendirme Kurulu (ler) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (ler) tarafından kullanımdan önce onaylanması gerekir. Bütün biyo-tehlikeli atıklar, ilgili kurum tarafından kararlaştırılan güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak imha edilmelidir. Bilmek ve bu işlem boyunca münasip güvenliğ…

Representative Results

P19'un de donduruldu hNPCs Şekil 5. Temsilcisi veri. A) Öngörülen hücre sayıları, sonra çözülmüş ve kesme yöntemi ile pasajlanır neurospheres karşılaştırıldığında enzimatik ayrılma kullanarak yapışık tek tabaka olarak genişletti. Hücreler p20 eritildi edildiğinde Gün 0 gösterir. B) küreler Temsilcisi …

Discussion

Şekil 6,
Şekil 6.. Doğrama şematik. Mekanik kesme yöntemini kullanarak kültür içinde sfero kök / progenitör hücreler genişletilmesi.

Kritik Adımlar

Kıyma genişleme paradigmasının bir bakış. HNPC küre boyutu neurospheres pasaj önce gözlemlemek için önemli kriterlerden biridir <strong…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz eleştiri ve bu raporun düzenleme için Dr Soshana Svendsen teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NINDS 1U24NS078370-01 ve CIRM DR2A-05320 ile katkıda bulunmuştur.

Materials

Beaker, 50 mL Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer  Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X) Life Technologies 12563-011
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. -. IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson’s disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 .
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. i. P. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington’s disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Tags

CGMPExpansion MethodNeural Stem CellsNeural Progenitor CellsPluripotent Stem CellsNeurospheresCell CultureMechanical PassagingAutomated ChoppingSuspension CultureCell YieldScale-upClinical-grade Cell Production

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image