Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale
Summary
Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.
Abstract
Una tecnica di espansione delle cellule ad accumulare un gran numero di cellule da un singolo esemplare per esperimenti di ricerca e studi clinici sarebbe di grande beneficio alla comunità di cellule staminali. Molti metodi di espansione attuali sono laboriosi e costosi, e quelli che coinvolgono completa dissociazione possono causare diversi tipi di staminali e cellule progenitrici di sottoporsi a una differenziazione o all'inizio senescenza. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo passaging meccanico automatizzato denominato "taglio" che è semplice e poco costoso. Questa tecnica evita dissociazione chimica o enzimatica in cellule singole e invece consente l'espansione su larga scala di sospensione, culture sferoidali che mantengono il contatto cellula / cellula costante. Il metodo di taglio è stato utilizzato principalmente per fetali cellule progenitrici neurali del cervello-derivato o neurosfere, ed è stato recentemente pubblicato per l'utilizzo con le cellule staminali neurali derivate da cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte. La procedura involves semina neurosfere su un piatto di coltura di tessuti Petri e in seguito una tagliente, la lama sterile attraverso le cellule automatizzare efficacemente il tedioso processo di manualmente dissociare meccanicamente ogni sfera. Sospendere cellule in coltura fornisce una superficie favorevole rapporto area-volume; come oltre 500.000 cellule possono essere coltivate in un singolo neurosfere inferiore a 0,5 mm di diametro. In un pallone T175, oltre 50 milioni di cellule possono crescere in colture in sospensione rispetto a solo 15 milioni nelle culture aderenti. È importante sottolineare che la procedura di taglio è stata utilizzata in corrente di buona fabbricazione (cGMP), permettendo la produzione di quantità di massa di prodotti di cellule clinico-grade.
Introduction
C'è una lunga storia di espansione delle cellule staminali neurali roditori nella cultura sia come monostrato 1-3 o neurosfere di aggregazione 4-7. Inoltre, le cellule progenitrici neurali umane (hNPCs) isolati da varie regioni del sistema nervoso centrale sviluppo 8-17 sono state espanse in vitro. Queste cellule sono bi-potente, in grado di differenziarsi in entrambi astrociti e neuroni e sono stati uno strumento molto utile per lo studio dello sviluppo neurale 18,19 e la malattia meccanismo 20,21. hNPCs sono stati trapiantati in molti diversi modelli animali di malattia del sistema nervoso centrale con diversi livelli di integrazione, sopravvivenza e effetti funzionali 22-24.
Tradizionalmente, roditori o NPC fetali derivate umani sono esposti a fattori di crescita – spesso fattore di crescita epidermico (EGF) e / o il fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF-2) 25-28 – e sia aderente 29 e treSistemi sferoidali-dimensionali sono in genere diversi passaggi utilizzando dissociazione enzimatica in una cella singola sospensione 30-34. Il metodo standard per espandere le cellule per la ricerca o l'uso clinico è come un monostrato aderente a causa di una facile manipolazione. Tuttavia, abbiamo dimostrato che passaging monostrato e neurosfere hNPCs con enzimatici o soluzioni chimiche portato nei primi mesi del senescenza 35. Inoltre, dissociazione enzimatica può provocare un aumento dei livelli di differenziazione e di anomalie del cariotipo sulla base di dati dimostrati con le cellule staminali embrionali 36-38. Anche se il metodo standard di hNPCs Passaging ha prodotto corrente di buona fabbricazione (cGMP) i prodotti di qualità che sono andati in fase 1 studi clinici (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), il metodo consentito solo un paio di giri di amplificazione delle cellule, limitando l' potenziale bancario.
Chiaramente, i grandi esperimenti di ricerca e studi clinici futuri potrebbero beneficiare della capacità dipropagare cellule in massa e con senescenza ritardata per consentire la crescita su larga scala e banking di cellule. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un modo nuovo e automatizzata di neurosfere intatte meccanicamente Passaging da "tagliare" li in piccoli gruppi per mantenere il contatto cellula-cellula. Questo metodo notevolmente aumentato la loro durata di vita 39 e la sospensione della cultura permette un uso più efficiente dello spazio incubatore rispetto a colture monostrato, come si è visto con 3D metodo di coltura del bioreattore alternativo 40. Il protocollo tagliere fornito permette la produzione di banche di grandi dimensioni da un campione fetale maggiore di passaggio 10, un'impresa improbabile utilizzando metodi passaging standard. Mentre questo metodo per hNPCs passaging è non convenzionale, sta crescendo in popolarità ed è stato recentemente, pubblicato con altri tipi di cellule come le cellule staminali neurali derivate da embrioni umani e cellule staminali pluripotenti indotte, consentendo l'espansione su larga scala per varie applicazioni, tra cui in vitro modellazione malattia 41-46. Soprattutto, una banca di cellule hNPC cGMP-grade è già stato prodotto con il metodo tagliere, dimostrando che la tecnica può essere applicata verso future applicazioni cliniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Figura 6. Tagliere schematica. Espansione cellule staminali sferoide / progenitrici nella cultura utilizzando il metodo di trinciatura meccanica.
Fasi critiche
Una panoramica del paradigma espansione tagliere è mostrato in Figura 6. HNPC dimensione della sfera è uno dei criteri …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Soshana Svendsen per la revisione critica e la modifica di questa relazione. Questo lavoro è stato contribuito per il NIH / NINDS 1U24NS078370-01 e CIRM DR2A-05320.
Materials
| Beaker, 50 mL | Fisherbrand | FB-100-50 | multiple manufacturers/suppliers |
| Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. or 6 ft. model. 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers |
| Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | multiple manufacturers/suppliers. CAUTION: Sharp |
| Cell Freezing Media | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, serum-free |
| Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts | Eppendorf | 5810 R | multiple manufacturers/suppliers |
| Conical Tubes, 15 mL | Fisherbrand | S50712 | multiple manufacturers/suppliers |
| Conical Tubes, 50 mL | BD Falcon | 352074 | multiple manufacturers/suppliers |
| Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | multiple manufacturers/suppliers |
| Cryovials, 2 mL | Corning | 430488 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T175 | BD Falcon | 353045 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T75 | BD Falcon | 353110 | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L | Millipore | SCGPU11RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL | Millipore | SCGVU01RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL | Millipore | SCGPU05RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL | Millipore | SCGP00525 | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter Paper, 8.5 cm circles | Whatman/GE | 1001-085 | |
| Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
| Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| Incubator, 37°C/5% CO2 | Forma | 370 series | multiple manufacturers/suppliers |
| Hemacytometer, Phase | Hausser Scientific | 1475 | multiple manufacturers/suppliers |
| McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | Petri dish modification required. CAUTION: Moving, sharp blade. |
| Micropipettor, 1 – 10 μL | Gilson | F144562 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Nutdriver, Autoclavable, 5/16" | Steritool | 10302 | |
| Pasteur Pipets, cotton-plugged | Fisherbrand | 13-678-8B | multiple manufacturers/suppliers |
| Petri Dish, Glass, Autoclavable | Corning | 3160-100 | |
| Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | multiple manufacturers/suppliers |
| Shim disc | McMaster-Carr | VARIABLE | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 10 μL | AvantGuard | AV10R-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 1000 μL | AvantGuard | AV1000 | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 20 μL | AvantGuard | AV20-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 200 μL | AvantGuard | AV200-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL | Fisherbrand | 13-676-10J | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL | Fisherbrand | 13-675-3C | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL | Fisherbrand | 13-676-10K | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL | Fisherbrand | 13-676-10H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterilization Pouches, 19 x 33 cm | Crosstex | SCL | multiple manufacturers/suppliers |
| Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | |
| Tissue Culture Dishes, 60 mm | BD Falcon | 351007 | |
| Tube Racks, Interlocking Four-Way | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| Water Bath | Fisherbrand | S52602Q | multiple manufacturers/suppliers |
| Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents | |||
| Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | Important to use the Stemline brand |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore | GF316 | multiple manufacturers/suppliers |
| Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | LIF1010 | multiple manufacturers/suppliers |
| Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
| TrypLE Select (1X) | Life Technologies | 12563-011 |
References
- Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
- Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
- Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
- Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
- Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
- Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
- Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
- Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
- Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
- Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
- Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
- Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
- Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
- Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
- Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
- Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. -. IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
- Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
- Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
- Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
- Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
- Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
- Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
- Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
- Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
- Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
- Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
- Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson’s disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
- Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
- Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 .
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
- Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Consortium, H. D. i. P. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington’s disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
- Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
- Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
- Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
- Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
- Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).
