Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.
Abstract
Ein Zellexpansion Technik, um eine große Zahl von Zellen, die aus einer einzelnen Probe für Forschungsexperimente und klinische Studien sammeln würde die Stammzell Gemeinschaft profitieren. Viele aktuelle Erweiterung Methoden sind aufwendig und teuer, und solche, die vollständige Dissoziation kann dazu führen, mehrere Stamm-und Vorläuferzelltypen, die Differenzierung oder frühen Seneszenz. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen automatisierten mechanischen Passagieren Verfahren als "Hacken", das einfach und kostengünstig ist bezeichnet entwickelt. Diese Technik vermeidet chemische oder enzymatische Dissoziation in Einzelzellen und ermöglicht die großflächige Erweiterung des suspendiert, Sphäroid-Kulturen, die konstant Zell / Zell-Kontakt zu halten, statt. Die Schneideverfahren hat sich vor allem für fötale Gehirn-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen oder Neurosphären verwendet wurden, und wurde kürzlich für die Verwendung mit neuronalen Stammzellen aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen veröffentlicht. Das Verfahren involves Aussaat Neurosphären auf einer Gewebekultur Petrischale und anschließend vorbei einen scharfen, sterilen Messer durch die Zellen effektiv die Automatisierung der mühsame Prozess der manuell mechanisch distanziert jede Kugel. Suspendieren der Zellen in der Kultur ein günstiges Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis; wie mehr als 500.000 Zellen können in einer einzelnen Neuro von weniger als 0,5 mm im Durchmesser wachsen. In einem Kolben T175 kann über 50 Millionen Zellen in Suspensionskulturen wachsen im Vergleich zu nur 15 Millionen in adhärenten Kulturen. Wichtig ist, dass das Hackverfahren gemäß der aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) eingesetzt, wodurch Massenmenge Produktion von klinischem Zellprodukte.
Introduction
Es gibt eine lange Geschichte der Erweiterung Nagetier neuralen Stammzellen in Kultur entweder als Monoschicht oder allgemeiner Neurosphären 1-3 4-7. Zusätzlich wurden menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu entwickeln 8-17 isoliert in vitro expandiert wurden. Diese Zellen sind bi-potent, und zur Differenzierung zu beiden Astrozyten und Neuronen und haben ein sehr nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der neuralen Entwicklung 18,19 und 20,21 Krankheitsmechanismus. hNPCs sind auch in vielen verschiedenen Tiermodellen der Krankheit des zentralen Nervensystems mit unterschiedlichen Stufen der Integration, das Überleben und die funktionalen Wirkungen 22-24 verpflanzt worden.
Oft epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und / oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) 25-28 – – und beide haft 29 und drei Traditionell Nagetier oder menschliche fötale NSC an Wachstumsfaktoren ausgesetztSphäroid-dimensionalen Systemen werden typischerweise unter Verwendung der enzymatischen Spaltung in eine Einzelzellsuspension 30-34 agiert. Die Standard-Methode, um Zellen für die Forschung oder die klinische Anwendung zu erweitern ist als Anhänger Monoschicht durch einfache Manipulation. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Passage Mono und Neurosphäre hNPCs mit enzymatische oder chemische Lösungen, führte im frühen Seneszenz 35. Darüber hinaus kann die enzymatische Spaltung bei erhöhten Differenzierung und karyotypischen Anomalien anhand von Daten mit embryonalen Stammzellen 36-38 gezeigt, führen. Obwohl die Standardmethode der Passage hat hNPCs aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) hochwertige Produkte, die in Phase 1 der klinischen Studien (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.) gegangen produziert, erlaubt die Methode nur ein paar Runden Zellamplifikation, die Begrenzung der Bank Potenzial.
Natürlich könnte große Forschungsexperimente und zukünftigen klinischen Studien von der Möglichkeit profitierenpropagieren Zellen in der Masse und mit verzögerter Seneszenz zu großen Wachstums-und Zellbanken zu ermöglichen. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir ein neues und automatisierten Weise mechanisch Passage intakter Neurosphären durch "Zerhacken" sie in kleinen Clustern auf Zell-Zell-Kontakt. Dieses Verfahren stark erhöht deren Lebensdauer 39 und Suspensionskultur ermöglicht eine effizientere Nutzung der Inkubator Platz im Vergleich zu Monolayer-Kulturen, wie bei einem alternativen 3D-Bioreaktor-Kultur-Methode 40 gesehen. Die zur Verfügung gestellten Hack-Protokoll ermöglicht die Produktion von großen Banken von einem fetalen Probe größer als Durchgang 10, eine unwahrscheinliche Leistung mit Standard-Methoden Passagieren. Während diese Methode für das Passagieren hNPCs ist unkonventionell, wird er immer beliebter, und wurde vor kurzem mit anderen Zelltypen wie neuronale Stammzellen aus menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen, so dass groß angelegte Erweiterung für verschiedene Anwendungen, einschließlich in v veröffentlichtitro Krankheit Modellierung 41-46. Wichtig ist, dass ein cGMP-grade hNPC Zellbank bereits mit dem Schneideverfahren hergestellt wurde, zeigt, dass die Technik zur zukünftigen klinischen Anwendungen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbildung 6. Chopping Schema. Erweiterung Sphäroid Stammzellen / Vorläuferzellen in Kultur mit Hilfe der mechanischen Hackmethode.
Kritische Schritte
Eine Übersicht des Hackexpansions Paradigma ist in Fig. 6 gezeigt. HNPC Kugelgröße ist einer der wichtigen Kriterien, die bei Pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Soshana Svendsen für kritische Überprüfung und Bearbeitung des vorliegenden Berichts. Diese Arbeit wurde durch das NIH / NINDS 1U24NS078370-01 und CIRM DR2A-05320 zu beigetragen.
Materials
| Beaker, 50 mL | Fisherbrand | FB-100-50 | multiple manufacturers/suppliers |
| Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. or 6 ft. model. 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers |
| Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | multiple manufacturers/suppliers. CAUTION: Sharp |
| Cell Freezing Media | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, serum-free |
| Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts | Eppendorf | 5810 R | multiple manufacturers/suppliers |
| Conical Tubes, 15 mL | Fisherbrand | S50712 | multiple manufacturers/suppliers |
| Conical Tubes, 50 mL | BD Falcon | 352074 | multiple manufacturers/suppliers |
| Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | multiple manufacturers/suppliers |
| Cryovials, 2 mL | Corning | 430488 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T175 | BD Falcon | 353045 | multiple manufacturers/suppliers |
| Culture Flask, Vented, T75 | BD Falcon | 353110 | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L | Millipore | SCGPU11RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL | Millipore | SCGVU01RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL | Millipore | SCGPU05RE | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL | Millipore | SCGP00525 | multiple manufacturers/suppliers |
| Filter Paper, 8.5 cm circles | Whatman/GE | 1001-085 | |
| Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
| Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| Incubator, 37°C/5% CO2 | Forma | 370 series | multiple manufacturers/suppliers |
| Hemacytometer, Phase | Hausser Scientific | 1475 | multiple manufacturers/suppliers |
| McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | Petri dish modification required. CAUTION: Moving, sharp blade. |
| Micropipettor, 1 – 10 μL | Gilson | F144562 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
| Nutdriver, Autoclavable, 5/16" | Steritool | 10302 | |
| Pasteur Pipets, cotton-plugged | Fisherbrand | 13-678-8B | multiple manufacturers/suppliers |
| Petri Dish, Glass, Autoclavable | Corning | 3160-100 | |
| Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | multiple manufacturers/suppliers |
| Shim disc | McMaster-Carr | VARIABLE | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 10 μL | AvantGuard | AV10R-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 1000 μL | AvantGuard | AV1000 | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 20 μL | AvantGuard | AV20-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile barrier pipet tips, 200 μL | AvantGuard | AV200-H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL | Fisherbrand | 13-676-10J | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL | Fisherbrand | 13-675-3C | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL | Fisherbrand | 13-676-10K | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL | Fisherbrand | 13-676-10H | multiple manufacturers/suppliers |
| Sterilization Pouches, 19 x 33 cm | Crosstex | SCL | multiple manufacturers/suppliers |
| Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | |
| Tissue Culture Dishes, 60 mm | BD Falcon | 351007 | |
| Tube Racks, Interlocking Four-Way | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| Water Bath | Fisherbrand | S52602Q | multiple manufacturers/suppliers |
| Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents | |||
| Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | Important to use the Stemline brand |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore | GF316 | multiple manufacturers/suppliers |
| Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | LIF1010 | multiple manufacturers/suppliers |
| Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
| TrypLE Select (1X) | Life Technologies | 12563-011 |
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