Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

Há uma longa história de expansão de células-tronco neurais de roedores na cultura tanto como uma monocamada ^1-3 ou ^4-7 neurospheres agregados. Além disso, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) isolados a partir de várias regiões do sistema nervoso central em desenvolvimento ^8-17 foram expandidas in vitro. Estas células são bi-potente, capaz de se diferenciar em ambos os astrócitos e neurônios e tem sido uma ferramenta muito útil no estudo do desenvolvimento neural ^18,19 e doença mecanismo ^20,21. hNPCs também têm sido transplantados em diversos modelos animais diferentes de doenças do sistema nervoso central, com diferentes níveis de integração, de sobrevivência e de efeitos funcionais ^22-24.

Tradicionalmente, o roedor ou NPCs fetais derivadas de humanos são expostas a factores de crescimento – factor de crescimento epidérmico, muitas vezes (EGF) e / ou fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2) ^25-28 – e ambos aderente ²⁹ e trêsSistemas de esferóides-dimensionais são tipicamente repicadas utilizando dissociação enzimática numa suspensão de células individuais ^30-34. O método padrão para expandir as células para a pesquisa ou uso clínico é como uma monocamada aderente devido à manipulação fácil. No entanto, temos mostrado que monocamada passaging e neuroesferas hNPCs com enzimática ou soluções químicas resultou em senescência precoce ^35. Além disso, a dissociação enzimática pode resultar em níveis aumentados de diferenciação e alterações cariotípicas com base em dados demonstrados com células estaminais embrionárias ^36-38. Embora o método padrão de hNPCs Passaging produziu atual boas práticas de fabrico (GMP) produtos de qualidade que passaram para a fase 1 de ensaios clínicos (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), o método permitiu apenas algumas rodadas de amplificação celular, limitando a potencial bancário.

Claramente, as grandes experiências de pesquisa e ensaios clínicos futuros poderiam se beneficiar da capacidade depropagar células a granel e com a senescência tardia para permitir o crescimento em grande escala e bancos de células. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma maneira nova e automatizada de neurospheres intactas Passaging mecanicamente por "cortar" os em pequenos grupos para manter contato célula-célula. Este método aumentou grandemente o seu tempo de vida e ³⁹ de suspensão de cultura permite uma utilização mais eficiente do espaço da incubadora em comparação com as culturas de monocamada, como pode ser visto com um método de cultura de biorreactor 3D alternativa ^40. O protocolo de desbastamento fornecida permite a produção de grandes bancos de uma amostra fetal maior do que a passagem 10, uma tarefa pouco provável usando métodos Passaging padrão. Enquanto este método para hNPCs Passaging é pouco convencional, que está crescendo em popularidade e foi recentemente publicado com outros tipos de células, como as células-tronco neurais derivadas de embriões humanos e células-tronco pluripotentes induzidas, permitindo a expansão em grande escala para várias aplicações, incluindo em vmodelagem de doenças ITRO ^41-46. Importante, uma cGMP-grau hNPC banco de células já foi produzida com o método de corte, o que demonstra que a técnica pode ser aplicada para aplicações clínicas futuras.