Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Hay una larga historia de la expansión de las células madre neurales de roedores en la cultura, ya sea como una monocapa ^1-3 o ^4-7 neuroesferas agregados. Además, las células progenitoras neurales humanas (hNPCs) aisladas a partir de diversas regiones del sistema nervioso central en desarrollo ^8-17 han sido expandidas in vitro. Estas células son bi-potentes, capaces de diferenciarse en astrocitos y neuronas y han sido una herramienta muy útil en el estudio del desarrollo neural ^18,19 y las enfermedades mecanismo de ^20,21. hNPCs también se han trasplantado en muchos modelos animales diferentes de enfermedad del sistema nervioso central con diferentes niveles de integración, la supervivencia y efectos funcionales ^22-24.

Tradicionalmente, roedor o NPC derivadas de fetos humanos están expuestos a factores de crecimiento – factor de frecuencia de crecimiento epidérmico (EGF) y / o factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) ^25-28 – y tanto adherente ²⁹ y tresSistemas de esferoide-dimensionales se pasan típicamente usando disociación enzimática en una suspensión de una sola célula ^30-34. El método estándar para expandir las células para la investigación o el uso clínico es como una monocapa adherente debido a la fácil manipulación. Sin embargo, hemos demostrado que los pases en monocapa y de neuroesferas con hNPCs enzimática o soluciones químicas resultaron en la senescencia temprana ^35. Además, la disociación enzimática puede dar lugar a mayores niveles de diferenciación y anomalías del cariotipo basados ​​en datos demostrados con células madre embrionarias ^36-38. Aunque el método estándar de hNPCs pases ha producido buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) productos de calidad que han pasado a la fase 1 de pruebas clínicas (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), el método permite únicamente un par de rondas de amplificación de células, lo que limita la banca potencial.

Está claro que los grandes experimentos de investigación y ensayos clínicos futuros podrían beneficiarse de la capacidad depropagar células en grandes cantidades y con el retraso en la senescencia para permitir el crecimiento a gran escala y de bancos de células. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado una forma novedosa y automatizado de neuroesferas intactos mecánicamente pases por "picar" en pequeños grupos para mantener el contacto de célula a célula. Este método aumenta en gran medida su vida útil ³⁹ y suspensión de cultivo permite un uso más eficiente del espacio de la incubadora en comparación con cultivos en monocapa, como se ve con un método de cultivo del biorreactor 3D alternativa ^40. El protocolo de cortar proporcionado permite la producción de bancos a gran escala a partir de una muestra fetal mayor que el paso 10, una hazaña poco probable utilizando métodos estándar pases. Si bien este método para hNPCs pases es poco convencional, que está creciendo en popularidad y fue recientemente publicado con otros tipos de células, como las células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas de embriones humanos y, lo que permite la expansión a gran escala para diversas aplicaciones incluyendo en vitro modelado enfermedad ^41-46. Es importante destacar que un cGMP grado banco de células hNPC ya se ha producido con el método de cortar, lo que demuestra que la técnica se puede aplicar a futuras aplicaciones clínicas.