Une méthode d'extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

Il ya une longue histoire de l'expansion des cellules souches neurales rongeurs en culture soit une monocouche ^1-3 ou ^4-7 neurosphères globales. En outre, les cellules progénitrices neurales humaines (hNPCs) isolés à partir de différentes régions du développement du système nerveux central ^8-17 ont été élargies in vitro. Ces cellules sont bi-puissant, capable de se différencier en astrocytes et les neurones les deux et ont été un outil très utile pour étudier le développement neural ^18,19 et ^20,21 mécanisme maladie. hNPCs ont également été transplantées dans de nombreux modèles de la maladie du système nerveux central des animaux différents avec différents niveaux d'intégration, à la survie et les effets fonctionnels ^22-24.

Traditionnellement, les rongeurs ou NPC foetales humaines dérivées sont exposés à des facteurs de croissance épidermique – souvent facteur de croissance (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) et ^{25 à 28} – ²⁹ à la fois adhérent et troisSystèmes de sphéroïdes dimensions sont généralement soumises à des passages en utilisant la dissociation enzymatique dans une suspension à cellule unique ^30-34. La méthode standard pour développer des cellules pour la recherche ou l'utilisation clinique est comme une monocouche adhérente raison d'une manipulation facile. Cependant, nous avons montré que des passages monocouches et neurosphères hNPCs avec des solutions chimiques ou enzymatiques ont donné lieu à la sénescence précoce ^35. En outre, la dissociation enzymatique peut entraîner une augmentation des niveaux de différenciation et des anomalies caryotypiques d'après les données démontré avec des cellules souches embryonnaires ^{de 36 à 38.} Bien que la méthode standard de hNPCs de passages a produit les bonnes pratiques de fabrication (BPF) des produits de qualité qui sont passés en phase 1 des essais cliniques (cellules souches Inc., Neuralstem Inc.), la méthode autorisée seulement quelques cycles d'amplification cellulaire, ce qui limite la potentiel bancaire.

De toute évidence, les grandes expériences de recherche et d'essais cliniques futurs pourraient bénéficier de la capacité depropager des cellules en vrac et à la sénescence retardée pour permettre la croissance à grande échelle et de banques de cellules. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une façon nouvelle et automatisé de neurosphères intactes mécaniquement passages par "couper" en petits groupes pour maintenir le contact de cellule à cellule. Ce procédé augmente considérablement leur durée de vie et la culture en suspension ³⁹ permet une utilisation plus efficace de l'espace de l'incubateur par rapport aux cultures en monocouche, comme on le voit avec une méthode de culture 3D de bioréacteur alternatif ^40. Le protocole permet de hachage prévu pour la production de banques à grande échelle d'un échantillon foetal supérieur passage 10, un exploit peu probable en utilisant des procédés standards de repiquage. Bien que cette méthode pour hNPCs de repiquage n'est pas conventionnelle, il est de plus en plus en popularité et a été récemment publié avec d'autres types tels que les cellules souches neurales dérivées de l'embryon humain et les cellules souches pluripotentes induites cellulaires, permettant l'expansion à grande échelle pour diverses applications, notamment dans vITRO modélisation de la maladie ^41-46. Surtout, un hNPC banque de cellules cGMP de qualité a déjà été produit avec le procédé de hachage, ce qui démontre que la technique peut être appliquée à de futures applications cliniques.