Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Professionele fagocyten, waaronder macrofagen, spelen een belangrijke in het immuunsysteem. Naast het feit dat de eerste lijn van defensie in het aangeboren immuunsysteem, ze een cruciale rol spelen bij de activering van de adaptieve immuniteit door hun signalering en antigeen-presenterende rol ^1-3. Terwijl de functie van professionele fagocyten is veelzijdig, phagosome rijping is de kritische ruggengraat van de bacteriedodende en antigeenverwerking functie van de professionele fagocyten ^4,5. Bij de receptor gemedieerde engulfment en opname van een fagocytaire doel, zoals bacteriën, de ontluikende phagosome gaat door een complexe en goed georkestreerde opeenvolging van interactie en uitwisseling met compartimenten van de endocytische netwerk en verscheidene andere celorganellen ^6. De aard van de verbindingen uitgewisseld met deze cellulaire entiteiten evenals de verordening en de timing van de fusie gebeurtenissen bepaalt de luminale phagosomal milieu en de phagosomal membraansamenstelling en dus ^7, het lot van de rijping phagosome ^8.

De fysiologische relevantie van phagosome rijping wordt geïllustreerd door de verschillende strategieën die door diverse intracellulaire pathogenen om te ontsnappen aan, arrestatie of ondermijnen phagosome rijping ^9. De meeste strategieën rechtstreeks verhinderen de laatste en kritieke fase van phagosome rijpingsproces: de fusie van phagosome met late endosomale / lysosomale compartimenten, die hen begiftigt met het grootste deel van de hydrolytische enzymen en antibacteriële factoren van een volwassen phagosome ^{7 , 8,10.} Analyse van deze laatste en cruciale stap daarom kan ons sterke indicatoren over de staat van rijping van de phagosomes en als de natuurlijke fysiologische toestand wordt positief of negatief beïnvloed onder de specifieke experimentele instellingen die worden gebruikt.

De late endosomale / lysosomale compartiments worden algemeen beschouwd de terminal compartimenten van de endocytische route, bepaald en onderscheiden van de vroege endocytische compartimenten door de aanwezigheid van verschillende, fase specifieke marker moleculen. Bijvoorbeeld hydrolytische enzymen of membraan componenten zoals Lysosomal geassocieerd membraaneiwitten (lampen) onder anderen ^11. De terminal endocytisch compartimenten-voortaan kortweg lysosomen-ook dienen als de belangrijkste locatie voor de laatste fasen van de spijsvertering aan het einde van de fagocytaire / endocytische route ^12. Zo kan verteerbare sondes door endocytose en macropinocytose het extracellulaire milieu geladen en getransporteerd door de endocytische route naar lysosomen, waar het zich ophoopt ^13,14 na na een bepaalde cyclus van opname en jacht. Fluorofoor geconjugeerde probes voor fluorescentiemicroscopie zoals organische verteerbare polymeer dextran worden vaak gebruikt als endocyticprobes ^15-17.

<p class = "jove_content"> In deze werkwijze beschrijven we het gebruik van IgG-beklede microkorrels als fagocytische lading phagosome rijping onderzocht door analyse van de afgifte van lysosomale luminale inhoud phagosomes. Door het gebruik van een fluorofoor-geconjugeerde dextran sonde als een gemakkelijk detecteerbare merker van lysosomen in levende beenmerg afgeleide macrofagen (BMM) en time-lapse video beeldvorming met een confocale laser scanning microscoop, volgen we het dynamische proces van lading levering in fagosomen met hoge temporele resolutie. Vervolgens beschrijven we hoe de verzamelde time-lapse imaging data kan worden geëvalueerd met behulp van de open-source en vrij beschikbare software voor beeldanalyse, Fiji (of ImageJ), statistisch geanalyseerd met behulp van Microsoft Excel en gepresenteerd met behulp van GraphPad Prism software ^14,18.

Na de beschrijving van onze werkwijze kunnen analoge experimenten ontworpen met gewijzigde instellingen factoren en hun invloed op phagosome rijping onderzoeken; vrijwel elke othaar type hechtende primaire of cellijn fagocytcellen, genetische verlies van functie experimenten, inclusief gen knock-out en knock-down, mutanten of expressie van fusie-eiwitten, fagocytaire-doelstellingen, microbead deklaagmengelingen, endosomale / lysosomale sondes en factoren zoals een cytokines, chemische inhibitoren of siRNA onder andere variabelen zijn die kunnen worden toegepast op de basisbenadering van deze methode.

We definiëren het doel en de fundamentele eisen van deze methode als volgt:

• Doel van de methode: de directe, kwantitatieve en kwalitatieve observatie en analyse van phagosome rijping met een hoge temporele resolutie in levende fagocytcellen schakelen.
• Fagocytische lading: Een ter zake gecoat microdeeltjes of biologische doel. Hier gebruiken we IgG-coated 3 micrometer sferische polystyreen microdeeltjes die gemakkelijk worden geïnternaliseerd via de Fc-γ receptor gemedieerde fagocytose. Als alternatief kan elk micro-organisme of gecoat microparticle waarvoor fagocytische receptor aanwezig is op de cellen kan worden gebruikt.
• Fagocyten: Hechtende fagocytische cellen die de juiste fagocytische receptoren. Hier gebruiken we de muis primaire BMMs die overvloedig de Fc-γ receptoren. Als alternatief zou dendritische cellen (DC), monocyten of fagocytaire epitheelcellen of hun genetische mutanten of knock-out varianten worden gebruikt.
• Lysosomale lading: Een fluorescent gelabelde lysosomale probe. Hier is Texas Red-geconjugeerd 70.000 kiloDalton dextran (Dex70kD) als het luminale lading van de lysosomen. Als alternatief kan elk fluorescent detecteerbare merker of een cellulair compartiment of organel, of een geschikte probe voor phagosomal eigenschappen zoals zuurgraad of afbrekende capaciteit kan worden gebruikt om de progressie van phagosome rijping bestuderen.
• Beïnvloedende factoren: bijvoorbeeld signaalmoleculen, chemische verbindingen, gen knock-down, of transiënte expressie van mutante eiwitten kon. Hier hebben we Förgeen het gebruik van een dergelijke factor voor de eenvoud maar een recent voorbeeld met mutant eiwitexpressie en neerhalen invloedsfactoren zie Kasmapour et al.. ¹⁸ Elke factor die invloed fagocytose of de omstandigheden en mobiliteit van phagosomes en / of de compartimenten die interageren met rijping phagosomes zou kunnen worden gebruikt.