Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Phagocytes professionnels, y compris les macrophages, joue un crucial dans le système immunitaire. En plus d'être la première ligne de défense du système immunitaire inné, ils jouent également un rôle essentiel dans l'activation de l'immunité adaptative par leur signalisation et présentant l'antigène rôle ^1-3. Bien que la fonction des phagocytes professionnels est à multiples facettes, phagosome maturation est l'épine dorsale critique de la fonction de traitement bactéricide et l'antigène des phagocytes professionnels ^4,5. Lors de l'immersion et de l'absorption d'une cible phagocytaires, tels que des bactéries médiée par le récepteur, le phagosome naissante passe par une séquence complexe et bien orchestrée de l'interaction et des échanges avec des compartiments du réseau d'endocytose et plusieurs autres organites cellulaires ^6. La nature des composés échangé avec ces entités cellulaires ainsi que la réglementation et le calendrier des événements de fusion détermine la luminale phagosome milieu et les phagoscomposition de omal de membrane et donc ^7, le sort du phagosome échéant le ^8.

La pertinence physiologique de maturation du phagosome est illustré par les diverses stratégies employées par les différents agents pathogènes intracellulaires d'échapper, arrêter ou renverser phagosome maturation ^9. La plupart de ces stratégies prévenir directement ou indirectement la phase finale et critique du processus de maturation du phagosome: la fusion de phagosome avec des compartiments fin endosomal / lysosomales, qui leur apporte l'essentiel des enzymes hydrolytiques et des facteurs anti-bactériennes du phagosome maturité ^{7 , 8,10.} L'analyse de cette étape finale et critique peut donc nous fournir des indicateurs solides sur l'état de maturation des phagosomes et si l'état physiologique naturel est d'être positivement ou négativement affecté dans les paramètres expérimentaux particuliers qui sont utilisés.

Le compartiment endosomes tardifs / lysosomess sont généralement considérés comme les compartiments de raccordement de la voie d'endocytose, définis et distingués des compartiments d'endocytose début par la présence de divers, en scène, des molécules spécifiques de marqueurs. Par exemple des enzymes hydrolytiques ou composants de la membrane telles que les protéines de la membrane lysosomale associés (lampes) entre autres ^11. Le terminal endocytose compartiments-appelée simplement comme lysosomes-servent également de l'emplacement principal pour les phases finales de la digestion à la fin de la voie de phagocytose / ¹² endocytose. De cette manière, des sondes non digestibles peuvent être chargés par l'intermédiaire de l'endocytose et macropinocytose le milieu extracellulaire et transportés à travers la voie d'endocytose vers les lysosomes, où il s'accumule ^13,14 après avoir suivi un cycle défini de l'absorption et de chasse. sondes conjugué à un fluorophore pour la microscopie fluorescente telle que le dextrane polymère organique non digestible sont couramment utilisés comme endocyticprobes ^15-17.

<p class = "jove_content"> Dans cette méthode, nous décrivons l'utilisation de microbilles recouvertes d'IgG en tant que cargaison phagocytaire d'enquêter phagosome maturation par l'analyse de la livraison de contenu lysosomale luminale de phagosomes. En utilisant une sonde dextran conjugué à un fluorophore comme un marqueur facilement détectable des lysosomes dans les macrophages os vivant de moelle dérivés (BMM) et vidéo en temps réel l'imagerie avec un microscope confocal à balayage laser microscope, nous suivons le processus dynamique de la livraison de marchandises en phagosomes à haute résolution temporelle. Nous décrivons ensuite comment les données d'imagerie time-lapse collectées peuvent être évaluées en utilisant open-source et disponible gratuitement le logiciel d'analyse d'image, Fidji (ou ImageJ), une analyse statistique en utilisant Microsoft Excel et présenté en utilisant le logiciel GraphPad Prism ^14,18.

Après la description de notre méthode, des expériences analogues peuvent être conçus en utilisant les paramètres et les facteurs modifiés pour étudier leur influence sur la maturation du phagosome, pratiquement n'importe quel otson type de cellules phagocytaires primaires ou de lignées cellulaires adhérentes, perte génétique des expériences de fonction incluant le gène knock-out et knock-down, mutants ou l'expression de protéines de fusion, phagocytaires-cibles, les produits de revêtement de microbilles, des sondes endosomal / lysosomal et des facteurs comme une cytokines, des inhibiteurs chimiques ou siRNA entre autres, sont autant de variables qui peuvent être appliqués à l'approche de base de cette méthode.

Nous définissons l'objectif et les exigences de base de cette méthode comme suit:

• Objectif de la méthode: pour permettre l'observation directe, quantitative et qualitative et l'analyse de la maturation du phagosome avec une haute résolution temporelle dans les cellules phagocytaires vivre.
• Cargaison phagocytaire: une microparticule revêtue de manière appropriée ou d'une cible biologique. Ici, nous utilisons recouvertes d'IgG 3 um microparticules sphériques de polystyrène qui sont facilement internalisées via le récepteur Fc-γ phagocytose médiée. Sinon, tout micro-organisme ou micro revêturoparticle pour lequel un récepteur phagocytaire est présent sur les cellules peut être utilisé.
• Les cellules phagocytaires: les cellules phagocytaires adhérentes exprimant les récepteurs phagocytaires appropriées. Ici, nous utilisons primaires BMMS de souris qui expriment les récepteurs Fc abondamment-γ. En variante, les cellules dendritiques (DC), les monocytes ou les cellules épithéliales phagocytaires ou à leurs mutants ou variants génétiques knock-out peuvent être utilisés.
• Lysosomale cargaison: Une sonde lysosomale marqué par fluorescence. Ici, le Texas Red-conjugué 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) est utilisé en tant que la cargaison de luminal des lysosomes. En variante, n'importe quel marqueur détectable par fluorescence d'un compartiment cellulaire ou organite, ou une sonde appropriée pour les propriétés de phagosome tels que l'acidité ou la capacité de dégradation, peut être utilisée pour étudier la progression de la maturation phagosome.
• Les facteurs d'influence: Par exemple, les molécules, les composés chimiques, gène knock-down, ou l'expression transitoire de protéines mutantes pourraient signalisation. Ici, nous avons FÖRGun l'utilisation d'un tel facteur pour des raisons de simplicité, mais pour un exemple récent avec l'expression de la protéine mutante et knock-down facteurs influençant s'il vous plaît voir Kasmapour et al. ¹⁸ Tout facteur qui peut affecter la phagocytose ou les circonstances et la mobilité des phagosomes et / ou les compartiments qui interagissent avec les phagosomes échéance pourraient être utilisés.