دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف
Abstract
الخلايا البلعمية تلعب دورا رئيسيا في نظام المناعة الفطرية عن طريق إزالة والقضاء على غزو الكائنات الحية الدقيقة في phagosomes بهم. يبلوع النضج هو عملية معقدة ومنظم بإحكام خلالها يبلوع الوليدة يخضع التحول جذرية من خلال التفاعلات مدبرة جيدا مع مختلف العضيات ومقصورات الخلوية في السيتوبلازم. هذه العملية، وهو أمر ضروري لوظيفة الفسيولوجية للخلايا البلعمية عن طريق تزويدها phagosomes مع ممتلكاتهم التحللي وجراثيم، ويتوج في انصهار phagosomes مع الجسيمات الحالة ونشوء حيوي من phagolysosomes الذي يعتبر المرحلة الأخيرة والحاسمة من النضج لphagosomes. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية القائمة على التحليل النوعي والكمي لعملية ديناميكية من يحلول ليبلوع تقديم المحتوى، والذي هو السمة المميزة ليحلول يبلوعي نشوء حيوي. يستخدم هذا النهج بلي مفتش المغلفة كنموذج لphagocytosis وfluorophore مترافق الجزيئات ديكستران باعتبارها اللمعية الليزوزومية التحقيق البضائع، من أجل متابعة تسليم ديناميكية من المحتويات lysosmal إلى phagosomes في الوقت الحقيقي في الضامة الحية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير والمسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. نحن هنا تصف بالتفصيل الخلفية، خطوات تحضير والإعداد خطوة بخطوة تجريبية لتمكين نشر سهلة ودقيقة لهذا الأسلوب في مختبرات أخرى. أسلوبنا وصف بسيط، قوية، والأهم من ذلك، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التفاعلات phagosomal والنضج في النظم المختلفة وتحت مختلف إعدادات التجريبية مثل استخدام مختلف أنواع الخلايا البلعمية، وفقدان وظيفة من التجارب، تحقيقات مختلفة، و جسيمات البلعمة.
Introduction
البالعات المهنية، بما في ذلك الضامة، تلعب حاسما في الجهاز المناعي. بالإضافة إلى كونها خط الدفاع الأول في نظام المناعة الفطرية، كما أنها تلعب دورا حاسما في تفعيل المناعة التكيفية من خلال إشارات وتقديم المستضد دورا 1-3. بينما وظيفة البالعات المهنية متعددة الأوجه، يبلوع النضج هو العمود الفقري الحرجة للجراثيم ومستضد تجهيز ظيفة البالعات المهنية 4،5. على مستقبلات بوساطة الإحاطة وامتصاص هدفا البلعمية، مثل البكتيريا، ويبلوع الوليدة يمر عبر سلسلة معقدة ومنسقة جيدا من التفاعل والتبادل مع مقصورات للشبكة التقامي والعديد من العضيات الخلوية الأخرى 6. طبيعة المركبات تبادلها مع هذه الكيانات الخلوية وكذلك تنظيم وتوقيت الأحداث الانصهار يحدد اللمعية phagosomal الوسط وphagosالعمال تكوين الغشاء، وبالتالي 7، مصير يبلوع النضج 8.
ويتمثل أهمية الفسيولوجية لليبلوع النضج من الاستراتيجيات المتنوعة التي تستخدمها مختلف مسببات الأمراض بين الخلايا للهروب من واعتقال أو تخريب يبلوع النضج 9. معظم هذه الاستراتيجيات بشكل مباشر أو غير مباشر منع المرحلة النهائية والحاسمة من عملية النضج يبلوع: انصهار يبلوع مع أواخر مقصورات endosomal / الليزوزومية، التي يمنحها لهم الجزء الأكبر من الانزيمات حلمهي والعوامل المضادة للبكتيريا من يبلوع ناضجة 7 ، 8،10. تحليل هذه الخطوة النهائية والحاسمة وبالتالي يمكن أن توفر لنا مؤشرات قوية حول حالة نضوج phagosomes وإذا كانت الدولة الفسيولوجية الطبيعية يجري تتأثر سلبا أو إيجابا تحت إعدادات معينة التجريبية التي يجري استخدامها.
مقصورة أواخر endosomal / الليزوزومية وتعتبر ليالي عموما أن تكون المقصورات محطة لمسار التقامي، الذي يعرف ومتميزة من المقصورات التقامي في وقت مبكر عن وجود مختلف، مرحلة محددة، والجزيئات علامة. على سبيل المثال الانزيمات حلمهي أو مكونات الأغشية مثل البروتينات المرتبطة غشاء الليزوزومية (مصابيح) وغيرها 11. محطة التقامي المشار المقصورات من الآن فصاعدا إلى مجرد الجسيمات الحالة أيضا بمثابة الموقع الرئيسي للمراحل النهائية من عملية الهضم في نهاية أكلة / التقامي مسار 12. بهذه الطريقة، يمكن تحميلها من خلال تحقيقات غير قابلة للهضم والإلتقام macropinocytosis من الوسط خارج الخلية ونقلها عبر مسار التقامي إلى الجسيمات الحالة، حيث يتراكم 13،14 بعد اتباع دورة محددة من امتصاص والمطاردة. وتستخدم المجسات-Fluorophore مترافق للفحص المجهري الفلورسنت مثل البوليمر العضوية ديكستران غير قابلة للهضم عادة باسم endocyticprobes 15-17.
<p clasق = "jove_content"> في هذه الطريقة، ونحن تصف استخدام بلي مفتش المغلفة كبضاعة البلعمية للتحقيق يبلوع النضج من خلال تحليل تسليم الليزوزومية المحتويات اللمعية لphagosomes. باستخدام مسبار ديكستران-fluorophore مترافق كعلامة كشفها بسهولة من الجسيمات الحالة في نخاع العظام الحية المستمدة الضامة (BMM) والوقت الفاصل بين التصوير الفيديو مع متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي، ونحن نتابع عملية ديناميكية من تسليم البضائع في phagosomes مع ارتفاع القرار الزماني. نحن ثم تصف كيف يمكن تقييم البيانات الوقت الفاصل بين التصوير التي تم جمعها باستخدام مفتوحة المصدر ومتاحة بحرية برمجيات تحليل الصور، فيجي (أو يماغيج)، وتحليلها إحصائيا باستخدام Microsoft Excel وعرضها باستخدام برامج GraphPad بريزم 14،18.بعد وصف أسلوبنا، والتجارب مماثلة يمكن تصميم باستخدام إعدادات والعوامل المعدلة للتحقيق تأثيرها على يبلوع النضج؛ تقريبا أي بعد التمديدنوع من الخلايا البلعمية لها الأولية أو خط خلية ملتصقة، وفقدان الوراثية من التجارب ظيفة بما في ذلك الجينات خروج المغلوب وتدق إلى أسفل، المسوخ أو التعبير عن البروتينات الانصهار، الأهداف، أكلة، ومركبات الطلاء microbead، تحقيقات endosomal / الليزوزومية ومثل هذه العوامل السيتوكينات، مثبطات الكيميائية، أو سيرنا من بين أمور أخرى كلها المتغيرات التي يمكن تطبيقها على النهج الأساسي من هذا الأسلوب.
نحدد الهدف والمتطلبات الأساسية لهذه الطريقة على النحو التالي:
- الهدف من طريقة: لتمكين الملاحظة المباشرة، الكمية والنوعية وتحليل يبلوع النضج مع القرار الزماني عالية في الخلايا الحية البلعمية.
- البضائع البلعمية: وmicroparticle المغلفة بشكل مناسب أو الهدف البيولوجية. نحن هنا استخدام مفتش المغلفة 3 ميكرون المجهرية الدقيقة البوليسترين كروية التي يتم المنضوية بسهولة عبر FC-γ مستقبلات بوساطة البلعمة. بدلا من ذلك، أي الكائنات الحية الدقيقة أو هيئة التصنيع العسكري المغلفةroparticle التي مستقبلات البلعمية موجود على خلايا يمكن استخدامها.
- الخلايا البلعمية: الخلايا البلعمية تمسكا معربا عن مستقبلات البلعمية المناسبة. نحن هنا استخدام الماوس BMMs الأولية التي تعبر بجلاء المستقبلات FC-γ. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم الخلايا الجذعية (DC)، وحيدات الخلايا الظهارية أو أكلة أو طفرات وراثية أو المتغيرات خروج المغلوب.
- الليزوزومية البضائع: A التحقيق الليزوزومية fluorescently المسمى. هنا، يتم استخدام تكساس الأحمر مترافق-70،000 kiloDaltons ديكستران (Dex70kD) مثل البضائع اللمعية من الجسيمات الحالة. بدلا من ذلك، أي علامة fluorescently كشف من حجرة الخلوية أو عضية، أو التحقيق الملائمة لخصائص phagosomal مثل الحموضة أو الهادمة القدرات، يمكن أن تستخدم لدراسة تطور يبلوع النضج.
- العوامل المؤثرة: على سبيل المثال، يشير الجزيئات، والمركبات الكيميائية، جين تدق إلى أسفل، أو التعبير عابرة للبروتينات متحولة يمكن. هنا، لقد forgواحد استخدام مثل هذا العامل من أجل البساطة، ولكن لمثال حديث مع متحولة التعبير البروتين وتدق إلى أسفل العوامل المؤثرة يرجى الاطلاع Kasmapour وآخرون 18 أي العوامل التي يمكن أن تؤثر على البلعمة أو الظروف والتنقل من phagosomes و / أو المقصورات التي تتفاعل مع phagosomes النضج يمكن استخدامها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في المقطع التالي سوف نناقش الخطوات الحاسمة من طريقة عرض وحدوده. أبعد من ذلك، ونحن سوف تواصل بعض المشاكل الشائعة مع حلولها، وإدخال التعديلات الممكنة والنظر في مزايا أسلوبنا فضلا عن أساليب تكميلية مناسبة لهذا النهج.
إعداد حبات، بم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر علم الأحياء يبلوع لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم هذا العمل من خلال منحة هيلمهولتز يونغ محقق (مبادرة وصناديق شبكات للجمعية هيلمهولتز) وبرنامج منح الأولوية SPP1580 مجلس البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث، DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
