Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo
Abstract
As células fagocíticas desempenhar um papel importante no sistema imune inato de remoção e eliminação de microrganismos invasores nas suas phagosomes. Maturação do fagossoma é o processo complexo e bem regulado durante o qual um phagosome nascente passa por uma transformação drástica por meio de interações bem orquestrados com diversas organelas celulares e compartimentos no citoplasma. Este processo, que é essencial para a função fisiológica das células fagocíticas, dotando phagosomes com suas propriedades líticas e bactericidas, culmina na fusão de fagossomos com lisossomos e biogênese de phagolysosomes que é considerada a última e crucial fase de maturação para phagosomes. Neste relatório, nós descrevemos um método baseado imagens de células vivas para a análise qualitativa e quantitativa do processo dinâmico de lisossoma para phagosome entrega de conteúdo, o que é uma característica da fagolisossomo biogênese. Esta abordagem utiliza microesferas IgG revestidas como um modelo para phagocytose e moléculas de dextrano fluoróforos como uma sonda de carga lisossômico luminal, a fim de acompanhar a entrega dinâmica de conteúdo lysosmal aos phagosomes em tempo real em macrófagos ao vivo usando imagens time-lapse e microscopia confocal a laser. Aqui vamos descrever em detalhe o plano de fundo, as etapas de preparação e configuração passo-a-passo experimental para permitir a implantação fácil e preciso desse método em outros laboratórios. Nosso método descrito é simples, robusta, e mais importante, pode ser facilmente adaptado para estudar as interações phagosomal e maturação em diferentes sistemas e em várias configurações experimentais, tais como uso de vários tipos de células fagocíticas, experiências de perda de função, as diferentes sondas e partículas fagocíticas.
Introduction
Fagócitos profissionais, incluindo macrófagos, desempenham um importante no sistema imune. Para além de ser a primeira linha de defesa do sistema imune inato, eles também desempenham um papel crítico na activação da imunidade adaptativa através da sua sinalização e apresentação de antigénio papel 1-3. Enquanto a função de fagócitos profissionais é multifacetada, maturação do fagossoma é crítica a espinha dorsal da função de processamento de antigénio e bactericida dos fagócitos profissionais 4,5. Após a imersão e absorção de um alvo fagocíticas, tais como bactérias receptor mediada, o fagossomo nascente passa por uma seqüência complexa e bem orquestrada de interação e intercâmbio com compartimentos da rede endocítica e várias outras organelas celulares 6. A natureza dos compostos trocados com essas entidades celulares, bem como a regulação e do calendário de eventos de fusão determina a phagosomal meio luminal e as phagoscomposição omal membrana e, portanto, 7, o destino do phagosome amadurecimento 8.
A relevância fisiológica da maturação do fagossoma é exemplificado pelas diversas estratégias empregadas por vários patógenos intracelulares para escapar, prender ou subverter maturação phagosome 9. A maioria destas estratégias directamente ou indirectamente impedir a fase final e crítica do processo de maturação do fagossoma: a fusão do fagossoma com tardias compartimentos endossomal / lisossomal, que lhes confere, com a maior parte das enzimas hidrolíticas e factores anti-bacteriana de um fagossoma madura 7 , 8,10. A análise desta etapa final e crítico, portanto, pode fornecer-nos com fortes indicadores sobre o estado de maturação das phagosomes e se o estado fisiológico natural está a ser positiva ou negativamente afetados nas configurações experimentais particulares que estão sendo utilizados.
O compartimento final endossomal / lisossomals são geralmente considerados como os compartimentos de terminais da via endocítica, definidos e distintos dos compartimentos endocíticas início com a presença de vários, Palco, moléculas marcadoras específicas. Por exemplo enzimas hidrolíticas ou componentes de membrana tais como proteínas de membrana Lysosomal associados (lâmpadas), entre outros 11. O terminal endocítico compartimentos-doravante referidos simplesmente como lisossomos-também servir como o principal local para as fases finais da digestão no final do fagocitária / endocítico caminho 12. Deste modo, as sondas não digeríveis podem ser carregados através de endocitose e macropinocitose do meio extracelular e transportado através da via endocítica para os lisossomas, onde se acumula 13,14 depois de seguir um ciclo de absorção definido e perseguição. Sondas fluoróforos para a microscopia de fluorescência, tais como o dextrano não digerível polímero orgânico são geralmente usados como endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> Neste método, que descrevem a utilização de micro-esferas revestidas com IgG como carga fagocítica investigar maturação do fagossoma, analisando a entrega do conteúdo luminal lisossomal para fagossomas. Ao usar uma sonda dextrano fluoróforo conjugado como um marcador facilmente detectável dos lisossomos na medula óssea ao vivo macrófagos derivados (BMM) e imagens de vídeo time-lapse com um microscópio de varredura a laser confocal, acompanhamos o processo dinâmico de entrega da carga em phagosomes com alta resolução temporal. Em seguida, descrevem como os dados de imagens de lapso de tempo coletados podem ser avaliados usando o código-fonte aberto e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente, Fiji (ou ImageJ), e analisados estatisticamente usando o Microsoft Excel e apresentados utilizando software GraphPad Prism 14,18.Após a descrição do nosso método, experiências análogas podem ser projetados usando as configurações e os fatores modificados para investigar sua influência na maturação phagosome; praticamente qualquer otseu tipo de células fagocíticas primárias ou de linha de células aderentes, perda genética de experimentos de função, incluindo gene knock-out e knock-down, mutantes ou expressão de proteínas de fusão, fagocíticas-alvos, compostos de revestimento microbead, sondas endosomal / lisossomais e fatores de citocinas, inibidores químicos, ou siRNA entre outros, são todos variáveis que podem ser aplicadas à abordagem básica deste método.
Definimos o objetivo e os requisitos básicos deste método da seguinte forma:
- Objetivo do método: para permitir a observação directa, quantitativa e qualitativa e análise de maturação do fagossoma com alta resolução temporal em células fagocíticas vivo.
- Carga fagocítica: Uma micropartícula apropriadamente revestidos ou alvo biológico. Aqui usamos IgG-revestido 3 mM micropartículas de poliestireno esféricas que são rapidamente internalizados através do receptor de Fc-γ fagocitose mediada. Alternativamente, qualquer microrganismo ou microfone revestidoroparticle para o qual um receptor de fagocítica está presente nas células pode ser utilizado.
- As células fagocíticas: células fagocíticas aderentes que expressam os receptores apropriados fagocíticas. Aqui usamos primários BMMs rato que abundantemente expressam os receptores Fc-γ. Alternativamente, as células dendríticas (DC), monócitos ou células epiteliais fagocíticas ou seus mutantes ou variantes genéticas knock-out podem ser usados.
- Carga Lysosomal: Uma sonda fluorescente etiquetado lisossômico. Aqui, conjugado com vermelho do Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) é usado como carga o lúmen dos lisossomos. Alternativamente, qualquer marcador detectável por fluorescência de um compartimento celular ou organelo, ou uma sonda adequada para propriedades phagosomal como acidez ou de degradação da capacidade, pode ser utilizado para estudar a progressão da maturação do fagossoma.
- Fatores que influenciam: Por exemplo, moléculas de sinalização, compostos químicos, gene knock-down, ou expressão transitória de proteínas mutantes poderia. Aqui, nós Forgum uso de tal fator para uma questão de simplicidade, mas para um exemplo recente com a expressão da proteína mutante e knock-down que influenciam fatores por favor ver Kasmapour et al. 18 Qualquer fator que pode afetar a fagocitose ou as circunstâncias e mobilidade dos phagosomes e / ou os compartimentos que interagem com phagosomes maturação poderia potencialmente ser usada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na seção seguinte, vamos discutir as etapas críticas do método apresentado e as suas limitações. Além disso, iremos ligar alguns dos problemas comuns com as suas soluções, introdução de modificações possíveis e considerar as vantagens de nosso método, bem como métodos complementares adequadas para esta abordagem.
A preparação dos grânulos, incluindo o acoplamento de IgG para a superfície do grânulo, é essencial e deve ser evitado o uso de preparações unfresh. Em adiç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do Laboratório de Biologia phagosome para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa e os fundos de rede da Associação Helmholtz) e um Programa Prioritário SPP1580 Grant do Conselho de Pesquisa Alemão (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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