Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo
Abstract
Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.
Introduction
Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor, el fagosoma naciente pasa a través de una secuencia compleja y bien orquestada de la interacción y los intercambios con compartimentos de la red endocítica y varios otros orgánulos celulares 6. La naturaleza de los compuestos intercambia con estas entidades celulares, así como la regulación y el calendario de eventos de fusión determina el medio phagosomal luminal y los fagoscomposición omal membrana y, por tanto, 7, el destino del fagosoma maduración 8.
La importancia fisiológica de la maduración del fagosoma se ejemplifica con las diversas estrategias empleadas por diversos patógenos intracelulares escapar, arrestar o subvertir fagosoma maduración 9. La mayoría de estas estrategias de evitar directa o indirectamente la etapa final y crítica del proceso de maduración fagosoma: la fusión de fagosoma con compartimientos endosomal / lisosomales finales de los años, que los dota de la mayor parte de las enzimas hidrolíticas y factores anti-bacterianas de un fagosoma madura 7 , 8,10. El análisis de este paso final y crítico, por tanto, nos puede proporcionar fuertes indicadores sobre el estado de maduración de los fagosomas, y si el estado fisiológico natural está siendo positiva o negativamente afectado bajo las condiciones experimentales particulares que se están utilizando.
El compartimento tarde endosomal / lisosomals son generalmente considerados como los compartimentos de terminales de la vía endocítica, definidos y distinguidos de los primeros compartimentos endocítica por la presencia de varios, Escenario, moléculas marcadoras específicas. Por ejemplo enzimas hidrolíticas o componentes de membrana tales como proteínas de la membrana lisosomal asociados (lámparas), entre otros 11. El terminal endocítica que se refiere compartimentos-de ahora en adelante simplemente como lisosomas-también sirven como la ubicación principal para las etapas finales de la digestión en el extremo de la fagocítica / endocítica vía 12. De esta manera, las sondas no digeribles se pueden cargar a través de endocitosis y macropinocitosis desde el medio extracelular y se transportan a través de la vía endocítica a los lisosomas, donde se acumula 13,14 después de seguir un ciclo definido de captación y Chase. Sondas conjugado con fluoróforo para microscopía fluorescente tal como el dextrano polímero orgánico no digerible se utilizan comúnmente como endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> En este método, se describe la utilización de microperlas recubiertas con IgG como carga fagocítica para investigar la maduración fagosoma mediante el análisis de la entrega de lisosomal contenido luminal a los fagosomas. Mediante el uso de una sonda de dextrano conjugado con fluoróforo como marcador fácilmente detectable de lisosomas en los macrófagos de la médula ósea en directo derivados (BMM) y time-lapse de imágenes de vídeo con un microscopio de escaneo láser confocal, seguimos el proceso dinámico de la entrega de la carga en los fagosomas con alta resolución temporal. A continuación describimos cómo los datos time-lapse recogidos pueden ser evaluados utilizando el código abierto y el software de análisis de imágenes de libre acceso, Fiji (o ImageJ), estadísticamente analizados usando Microsoft Excel y se presenta utilizando el software GraphPad Prism 14,18.Después de la descripción de nuestro método, experimentos análogos pueden ser diseñados utilizando la configuración y factores modificados para investigar su influencia sobre la maduración fagosoma; prácticamente cualquier OTsu tipo de células fagocíticas primarios o de líneas de células adherentes, la pérdida genética de los experimentos de la función incluyendo genes knock-out y knock-down, mutantes o expresión de proteínas de fusión, fagocíticas-objetivos, compuestos de revestimiento microbead, sondas endosomal / lisosomales y factores como un citoquinas, inhibidores químicos, o ARNsi entre otros son todas las variables que se pueden aplicar para el enfoque básico de este método.
Definimos el objetivo y los requisitos básicos de este método de la siguiente manera:
- Objetivo del método: para permitir la observación directa, cuantitativa y cualitativa y el análisis de la maduración del fagosoma con alta resolución temporal en las células fagocíticas viviente.
- Fagocítica de carga: Una micropartícula adecuadamente recubiertos o diana biológica. Aquí se utiliza recubiertas de IgG-3 micras micropartículas esféricas de poliestireno que se internalizan fácilmente mediante el receptor de Fc-γ fagocitosis mediada. Alternativamente, cualquier microorganismo o micrófono revestidoroparticle para que un receptor fagocítico está presente en las células se puede utilizar.
- Las células fagocíticas: células fagocíticas adherentes que expresan los receptores fagocíticas apropiados. Aquí usamos primarias BMMs de ratón que expresan abundantemente los receptores Fc-γ. Alternativamente, se podrían utilizar células dendríticas (DC), monocitos o células epiteliales fagocíticas o sus mutantes o variantes genéticos knock-out.
- Lysosomal de carga: Una sonda lisosómico marcado con fluorescencia. Aquí, Texas conjugado-Rojo 70000 kilodaltons de dextrano (Dex70kD) se utiliza como la carga luminal de los lisosomas. Alternativamente, cualquier marcador fluorescente detectable de un compartimiento celular o de orgánulos, o una sonda apropiada para las propiedades phagosomal tales como la acidez o de degradación de la capacidad, se podría utilizar para estudiar la progresión de la maduración del fagosoma.
- Factores de influencia: por ejemplo, las moléculas de señalización, compuestos químicos, genes knock-down, o la expresión transitoria de proteínas mutantes podían. Aquí, hemos forguno el uso de ese factor en aras de la simplicidad, pero para un ejemplo reciente con la expresión de la proteína mutante y derribo factores que influyen en favor ven Kasmapour et al. 18 Cualquier factor que puede afectar la fagocitosis o por las circunstancias y la movilidad de los fagosomas y / o los compartimentos que interactúan con los fagosomas vencimiento podrían ser utilizadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque.
La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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