ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם
Summary
בסרטון זה אנו מדגימים פרוטוקול לניתוח שריר העבדות של העכבר ומשתמשים בכשל חיסוני ובמיקרוסקופיה כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים.
Abstract
ניתוח של מורפולוגיה צומת neuromuscular יכול לתת תובנה חשובה על המצב הפיזיולוגי של נוירון מוטורי נתון. ניתוח של שרירים שטוחים דקים יכול להציע יתרון משמעותי על פני שרירים עבים המשמשים באופן מסורתי, כגון אלה של האיבר האחורי (למשל. גסטרוקנמיוס). שרירים דקים מאפשרים סקירה מקיפה של כל תבנית innervation לשריר נתון, אשר בתורו מאפשר זיהוי של בריכות פגיעות באופן סלקטיבי של נוירונים מוטוריים. שרירים אלה מאפשרים גם ניתוח של פרמטרים כגון גודל יחידה מוטורית, הסתעפות אקסונלית ונבטים סופניים/נודאליים. מכשול נפוץ בשימוש בשרירים כאלה הוא השגת המומחיות הטכנית לנתח אותם. בסרטון זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול לנתח את השריר transversus abdominis (TVA) מעכברים צעירים וביצוע immunofluorescence לדמיין אקסונים וצמתים neuromuscular (NMJs). אנו מראים כי טכניקה זו נותנת סקירה מלאה של דפוס innervation של שריר TVA והוא יכול לשמש כדי לחקור פתולוגיה NMJ במודל העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות, ניוון שרירים בעמוד השדרה.
Introduction
צמתים נוירומוסקולריים (NMJs) הם הקשר הסינפטי בין נוירון מוטורי נמוך יותר לבין סיבי שריר השלד. הם נחשבים באופן מסורתי סינפסה משולשת, המורכב נוירון (מסוף presynaptic), סיבי שריר (מסוף סינפטית פוסט), ותא מסוף שוואן1. NMJs נראה מטרות מוקדמות ומשמעותיות בפתולוגיה במגוון של מחלות נוירון מוטורי ומודלים העכבר2,3. תסמינים אופייניים כוללים denervation, שבו endplate המנוע הופך נטול innervation presynaptic, נפיחות של הטרמינל presynaptic, וירידה במורכבות של מורפולוגיה NMJ4-11. ניתן גם לציין תגובות מפצות, הכוללות נבטים סופניים ונודאליים, שבהם תהליכים אקסונליים נמשכים ממסופים סינפטיים או מתמחים שנותרו ועד לוחות קצה מנוריםמחדש 12,13. בשל המתאם ההדוק בין פעילות סינפטית מורפולוגיה NMJ, הרבה מידע ניתן להשיג על המצב התפקודי של נוירונים מוטוריים מניתוח של מורפולוגיה NMJ. כמו אובדן של NMJs לעתים קרובות מייצג את אחד ההיבטים הראשונים של פתולוגיה neuromuscular4,10, כימות ברמה של innervation יכול לתת מידע חשוב על התקדמות הפתולוגיה ואת ההשפעה הפוטנציאלית של התערבות טיפולית. יתר על כן, כמו הפסד NMJ מייצג צעד משמעותי בהתקדמות פתולוגית, הפיתוח של טיפולים שיכולים לייצב קשרים ולעודד התחדשות עשוי להניב תועלת משמעותית.
בעת ניתוח מורפולוגיה NMJ, בחירת שרירים היא בעלת חשיבות רבה. חלק מהשיקולים העיקריים עשויים לכלול סוג סיבי שריר, מיקום הגוף, וניתוח השוואתי למצבים אנושיים. בנוסף, כאשר נדרשות מניפולציות כגון הזרקת חומרים או פגיעה עצבית טראומטית, חשוב גם לשקול נגישות ניסיונית. באופן כללי, עדיף לנתח מגוון של שרירים הממוקמים בכל הגוף המשקפים מגוון של תת-סוגים של יחידות מוטוריות. לעתים קרובות, עם זאת, בחירת שרירים מושפעת על ידי קלות של ניתוח. כתוצאה מכך, ניתוח NMJ מבוצע לעתים קרובות אך ורק על שרירי נספח גדולים כגון gastrocnemius. כדי להשיג כתמי NMJ טובים בשרירים כאלה, חתך או הפרעה מכנית של סיבי שריר נדרש לעתים קרובות. כתוצאה מכך, דפוס innervation עלול להיות משובש וניתוח מקיף ואיכותי של דפוסי innervation, נבטים ו denervation נפגע לעתים קרובות. גישה חלופית היא להשתמש בשרירים שטוחים דקים שאינם דורשים חתך וניתן להכתים ולהרכיב ללא פגע, המאפשר סקירה מקיפה של כל innervation של השריר. ישנם מספר שרירים אשר ניתן להשתמש בהם לניתוח כזה, כולל קבוצה של שרירי הגולגולת, (מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus)14, שרירי בית החזה (למשל. טריאנגולריס סטרני) 15, ובטן (למשל transversus abdominis (TVA)) השרירים. המכשול העיקרי בשימוש בשרירים כאלה הוא המומחיות הטכנית הנדרשת כדי לנתח אותם ללא נזק.
בסרטון זה, אנו מספקים פרוטוקול לנתח ולבצע תיוג immunofluorescent של שריר TVA מן העכבר כדי לאפשר ניתוח מקיף של דפוס innervation ומורפולוגיה NMJ. שריר TVA הוא שריר עווית איטי בעיקר הכולל את השכבה העמוקה ביותר של שריר הבטן והוא innervated על ידי העצבים הבין צלעיים התחתון. עבודה קודמת הוכיחה את זה להיות פגיע מאוד באופן עקבי פתולוגיה במספר מודלים של העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) ובמודלים אחרים של העכבר של ניוון נוירון מוטורי תחילת מוקדם4,16. לכן אנו מציעים כי TVA הוא שריר שימושי עבור ביצוע ניתוח NMJ נוירופתיות היקפיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בסרטון זה, יש לנו פרוטוקול לניתוח של שריר TVA מן העכבר עבור תיוג immunofluorescent כל ההר של NMJs בתוך השריר. אנו מציגים גם נתונים המראים כי שריר זה יכול לשמש לניתוח פתולוגיה צומת neuromuscular במודל העכבר של SMA.
הצלחה בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. חלק מהבעיות הנפוצות ביותר מפורטות להלן. ראשית: כתמים אימונוהיסטוכימיים ירודים. יכולות להיות מספר סיבות לכך, אחת הסיבות הנפוצות ביותר להיות שימוש ריאגנטים שונים לאלה המפורטים בפרוטוקול זה. PFA באיכות גבוהה מיקרוסקופיה אלקטרונים חשוב מאוד כדי להבטיח כתמים טובים, כמו גם הבחירה של נוגדנים המפורטים בפרוטוקול זה. בנוסף, בבעלי חיים מבוגרים(כלומר> 3 חודשים), מקבל כתמים באיכות טובה יכול להיות קשה יותר. הסיבה לכך היא עובי מוגבר של fascia המקיף את השריר ואת הגידול בצבירת השומן בין אלכסון חיצוני טרנוורוס abdominis. חשוב להסיר את השומן, לפני שתמשיך לכשל חיסוני. ייתכן גם שיהיה צורך להסיר חלק fascia מכסה את השריר, אשר יכול להיות מעובה. לפעמים קשה להפשיט את fascia ושומן מן השריר מבלי לגרום נזק כלשהו סיבי השריר הפרעה דפוס innervation. עם זאת, אם טכניקה זו מבוצעת בקפידה, כתמים באיכות טובה ניתן לרכוש מעכברים עד גיל שנה לפחות. בעכברים צעירים יותר(כלומרפחות מ 3 חודשים של גיל) זה לא צריך להיות נחוץ כדי לבצע כל מתגרה או הפרדה של סיבי שריר. שנית: קשה למצוא NMJs בעקבות ניתוח וכתמים. הסיבה לכך היא לעתים קרובות כי הניתוח לא השתרע מתחת לצלעות האחרונות. רוב NMJs ממוקמים ממש מתחת לצלע האחרונה ולכן יש להקפיד כדי להבטיח חלק זה של השריר כלול ניתוח. שלישית: דבקות בשריר ה-EO בשריר ה-TVA. זוהי לעתים קרובות תלונה כאשר אנשים מנסים להאריך את הניתוח מתחת לרמה של השריר הפנימי אלכסוני (IO). האזור של שריר TVA שבו IO הוא גם נוכח קשה יותר לנתח כפי שהוא יכול להיות קשה להבחין איזה שריר הוא אשר. מסיבה זו, אנחנו באופן שגרתי רק לנתח את החלק העליון ביותר של שריר TVA. ברמה זו, אין דבקות בין שרירי EO ו TVA, ולכן זה לא צריך להיות בעיה משמעותית.
מכשול משמעותי אחד לשימוש בשריר TVA, בהשוואה לשרירי התוספתן, הוא נגישות למניפולציות כירורגיות או להזרקת חומרים. סוגים אלה של ניסויים יכולים להיות חיוניים כדי לחקור את הפיזיולוגיה של NMJ בשריר נתון. למרות TVA הוא בהחלט פחות נגיש בקלות מאשר שרירים נפוצים יותר כגון tibialis anterior או gastrocnemius, עבודה קודמת הוכיחה שניתן denervate TVA על ידי פציעה כירורגית של העצבים הבין צלעיים18. לאחרונה השתמשנו גם שריר זה לניהול מקומי של חומרים תחת הרדמה כללית (נתונים שלא פורסמו). למרות ניסויים אלה יכולים לייצג אתגר טכני מתון, עבודה זו מראה כי הם אפשריים ובכך להרחיב את התועלת של שריר זה לניתוח של NMJs תחת מניפולציה פתולוגית ופיזיולוגית כאחד.
שריר TVA הוא אחד ממספר שרירים שטוחים דקים הממוקמים בכל הגוף שניתן להשתמש בהם לניתוח הרכבה שלם של דפוסי innervation. שרירים אחרים כוללים קבוצה של שרירי גולגולת פנימיים על ידי נוירונים מוטוריים שמקורם גרעין הפנים של גזע המוח, מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus, את הניתוחים אשר תוארו בעבר14,19. יתר על כן, השרירים המקיפים את שריר TVA, כולל EO, IO, ו rectus abdominis, ניתן גם לתייג ולהשתמש לניתוח NMJ. לניתוח מקיף של פתולוגיה NMJ במודל העכבר, חשוב לשקול מספר שרירים הממוקמים בכל הגוף ולא להגביל את הניתוח לשריר אחד. זה בא לידי ביטוי במודלים העכבר של מחלות נוירון מוטורי שבו יש הטרוגניות משמעותית ברמות של פתולוגיה NMJ בין השרירים השונים20. שונות בין שרירית כזו היא כלי בעל ערך רב כאשר חוקרים את המנגנון של פגיעות נוירון מוטורי ולכן הגבלת ניתוח לשריר יחיד יכול להפחית באופן משמעותי את הפוטנציאל של המחקר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (מספר מענק MOP 38040) ל- R.K., איגוד ניוון השרירים (ארה”ב) ל- R.K., משפחות SMA ל- R.K. ו- L.M.M, קרן SMA ל- T.H.G., וקמפיין ניוון השרירים ל- T.H.G.. L.M.M הוא מקבל של אגודת טרשת נפוצה של קנדה פוסט דוקטורט מלגת, ו R.K. הוא מקבל של קתדרה לחקר הבריאות באוניברסיטה מאוניברסיטת אוטווה.
Materials
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
