Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse
Summary
In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.
Abstract
Die Analyse der neuromuskulären Knotenmorphologie kann wichtige Einblicke in den physiologischen Status eines bestimmten motorischen Neurons geben. Die Analyse dünner flacher Muskeln kann gegenüber traditionell verwendeten dickeren Muskeln, wie z.B. aus der Hinterbeinen (z.B.. gastrocnemius). Dünne Muskeln ermöglichen einen umfassenden Überblick über das gesamte Innervationsmuster eines bestimmten Muskels, was wiederum die Identifizierung selektiv anfälliger Becken von motorischen Neuronen ermöglicht. Diese Muskeln ermöglichen auch die Analyse von Parametern wie Motoreinheitsgröße, axonale Verzweigung und Terminal/Knoten-Spriegung. Ein häufiges Hindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist die Gewinnung des technischen Know-hows, um sie zu sezieren. In diesem Video beschreiben wir das Protokoll zur Zerkleinerung des Transversus Abdominis (TVA) Muskels von jungen Mäusen und zur Durchführung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung von Axonen und neuromuskulären Knoten (NMJs). Wir zeigen, dass diese Technik einen vollständigen Überblick über das Innervationsmuster des TVA-Muskels gibt und zur Untersuchung der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell der motorischen Neuronenerkrankung im Kindesalter, spinaler Muskelatrophie, verwendet werden kann.
Introduction
Neuromuskuläre Knoten (NMJs) sind die synaptische Verbindung zwischen einem unteren motorischen Neuron und einer Skelettmuskelfaser. Sie gelten traditionell als dreigliedrige Synapse, bestehend aus einem Neuron (präsynaptisches Terminal), Muskelfaser (postsynaptische Seat) und terminalschwann Zelle1. NMJs scheinen frühe und signifikante Ziele in der Pathologie in einer Reihe von motorischen Neuronenerkrankungen und Mausmodellen zu sein2,3. Typische Symptome sind Dieervation, wo die Motorendplatte frei von einer präsynaptischen Innervation, Schwellung des präsynaptischen Terminals und einer Verringerung der Komplexität derNMJ-Morphologie 4-11wird. Kompensatorische Reaktionen können auch festgestellt werden, einschließlich Terminal- und Knotenkeimung, wo axonale Prozesse von verbleibenden synaptischen Klemmen oder Internoden bis hin zu reinvierten denervierten Endplatten12,13reichen. Aufgrund der engen Korrelation zwischen synaptischer Aktivität und NMJ-Morphologie können aus der Analyse der NMJ-Morphologie viele Informationen über den funktionellen Status von motorischen Neuronen gewonnen werden. Da der Verlust von NMJs häufig einen der ersten Aspekte der neuromuskulären Pathologiedarstellt 4,10, kann die Quantifizierung auf der Ebene der Innervation wichtige Informationen über das Fortschreiten der Pathologie und die mögliche Wirkung einer therapeutischen Intervention geben. Da der NMJ-Verlust einen bedeutenden Schritt in der pathologischen Progression darstellt, kann die Entwicklung von Therapeutika, die Verbindungen stabilisieren und die Regeneration fördern können, einen erheblichen Nutzen bringen.
Bei der Analyse der NMJ-Morphologie ist die Muskelwahl von großer Bedeutung. Einige der primären Überlegungen können Muskelfasertyp, Körperposition und vergleichende Analyse zu menschlichen Bedingungen umfassen. Darüber hinaus ist, wenn Manipulationen wie Injektion von Substanzen oder traumatische Nervenverletzungen erforderlich sind, auch die experimentelle Zugänglichkeit zu berücksichtigen. Im Allgemeinen ist es vorzuziehen, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu analysieren, die eine Reihe von Motoreinheiten-Subtypen widerspiegeln. Oft wird die Muskelwahl jedoch durch die einfache Zerlegung beeinflusst. Folglich wird die NMJ-Analyse oft ausschließlich an großen Anhängsmuskelmuskeln wie Gastrocnemiusdurchgeführt. Um eine gute NMJ Färbung in solchen Muskeln zu erhalten, ist oft Schnitt oder mechanische Störung der Muskelfasern erforderlich. Als Ergebnis kann das Innervationsmuster gestört werden und eine umfassende und qualitativ hochwertige Analyse von Innervationsmustern, Keimen und Denervation wird oft beeinträchtigt. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung dünner flacher Muskeln, die keine Schnitte erfordern und intakt gebeizt und montiert werden können, was einen umfassenden Überblick über die gesamte Innervation des Muskels ermöglicht. Es gibt eine Reihe von Muskeln, die für eine solche Analyse verwendet werden können, einschließlich einer Gruppe von Schädelmuskeln, (einschließlich Levator auris longus, auricularis superior, und Adduktoren auris longus)14, Brustmuskeln (z.B.. triangularis sterni) 15, und Bauchmuskeln(z.B. transversus abdominis (TVA)). Das Haupthindernis bei der Verwendung solcher Muskeln ist das technische Know-how, das erforderlich ist, um sie ohne Schäden zu sezieren.
In diesem Video stellen wir ein Protokoll zur Sezieren und Durchführung von immunfluoreszierender Kennzeichnung des TVA-Muskels von der Maus zur Verfügung, um eine umfassende Analyse des Innervationsmusters und der NMJ-Morphologie zu ermöglichen. Der TVA-Muskel ist ein überwiegend langsamer Zuckmuskel, der die tiefste Schicht der Bauchmuskulatur umfasst und durch die unteren interkostalen Nerven innerviert wird. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es konsequent sehr anfällig für Pathologie in einer Reihe von Mausmodellen der Kindheit motorischen Neuronenkrankheit spinale Muskelatrophie (SMA) und in anderen Mausmodellen der frühen einsetzenden motorischen Neuronendegeneration4,16. Wir schlagen daher vor, dass das TVA ein nützlicher Muskel für die Durchführung von NMJ-Analysen in peripheren Neuropathien ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Video haben wir ein Protokoll für die Zerlegung des TVA-Muskels von der Maus und für die ganzmontierte immunfluoreszierende Kennzeichnung von NMJs innerhalb des Muskels detailliert beschrieben. Wir präsentieren auch Daten, die zeigen, dass dieser Muskel verwendet werden kann, um neuromuskuläre Knotenpathologie in einem Mausmodell von SMA zu analysieren.
Der Erfolg dieser Technik hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Einige der häufigsten Probleme werden im Folgenden beschrieben. Erstens: schlechte immunhistochemische Färbung. Es kann eine Reihe von Gründen dafür geben, einer der häufigsten ist die Verwendung von verschiedenen Reagenzien zu denen, die in diesem Protokoll aufgeführt sind. Eine hochwertige Elektronenmikroskopie Qualität PFA ist sehr wichtig, um eine gute Färbung zu gewährleisten, wie die Wahl der Antikörper in diesem Protokoll aufgeführt sind. Darüber hinaus kann bei älteren Tieren(d.h.> 3 Monaten) eine gute Färbung schwieriger sein. Dies ist aufgrund der erhöhten Dicke der Faszien um den Muskel und die Zunahme der Fettansammlung zwischen der äußeren Schräglage und Tranversus Abdominis. Es ist wichtig, das Fett abzustreifen, bevor Sie zur Immunfluoreszenz übergehen. Es kann auch notwendig sein, einige der Faszien abzustreifen, die den Muskel bedecken, die verdickt werden können. Es ist manchmal schwierig, die Faszien und Fett aus dem Muskel zu entfernen, ohne einige Schäden an der Muskelfaser und eine Störung des Innervationsmusters. Wenn diese Technik jedoch sorgfältig durchgeführt wird, kann eine gute Färbung von Mäusen bis mindestens 1 Jahr erworben werden. Bei jüngeren Mäusen(d.h.weniger als 3 Monate alt) sollte es nicht notwendig sein, eine Hänseleien oder Trennung von Muskelfasern durchzuführen. Zweitens: schwierig bei der Suche nach NMJs nach Sezieren und Färben. Dies liegt oft daran, dass sich die Sezierung unter der letzten Rippe nicht verlängert hat. Die meisten NMJs befinden sich direkt unter der letzten Rippe und daher muss darauf geachtet werden, dass dieser Teil des Muskels in der Zerlegung enthalten ist. Drittens: Die Haftung des EO-Muskels am TVA-Muskel. Dies ist oft eine Beschwerde, wenn Einzelpersonen versuchen, die Sektion unter dem Niveau der inneren Schrägstrich (IO) Muskel zu verlängern. Der Bereich des TVA-Muskels, in dem auch die IO vorhanden ist, ist schwieriger zu analysieren, da es schwierig sein kann, zu unterscheiden, welcher Muskel welche ist. Aus diesem Grund sezieren wir routinemäßig nur den überlegensten Teil des TVA-Muskels. Auf dieser Ebene gibt es keine Haftung zwischen der EO und TVA Muskeln, und daher sollte dies kein signifikantes Problem sein.
Ein erhebliches Hindernis für die Verwendung des TVA-Muskels, im Vergleich zu appendicular Muskeln, ist zugänglich für chirurgische Manipulationen oder Injektion von Substanzen. Diese Arten von Experimenten können entscheidend sein, um die NMJ-Physiologie in einem bestimmten Muskel zu untersuchen. Obwohl der TVA sicherlich weniger leicht zugänglich ist als häufiger verwendete Muskeln wie tibialis anterior oder gastrocnemius, hat frühere Arbeiten gezeigt, dass es möglich ist, den TVA durch chirurgische Verletzung der Interkostalnerven zu denervate18. Wir haben diesen Muskel vor kurzem auch für die lokale Verabreichung von Substanzen unter Vollnarkose (unveröffentlichte Daten) verwendet. Obwohl diese Experimente eine moderate technische Herausforderung darstellen können, zeigt diese Arbeit, dass sie machbar sind und somit die Nützlichkeit dieses Muskels für die Analyse von NMJs unter pathologischer und physiologischer Manipulation erweitern.
Der TVA-Muskel ist einer von mehreren dünnen flachen Muskeln im ganzen Körper, die für die Gesamt-Mount-Analyse von Innervationsmustern verwendet werden können. Andere Muskeln umfassen eine Gruppe von Schädelmuskeln, die durch motorische Neuronen, die aus dem Gesichtskern des Hirnstamms stammen, innerviert werden und Levator auris longus, auricularis superiorund Adduktoren auris longusumfassen, deren Dissektionen zuvor14,19beschrieben wurden. Darüber hinaus kann die Muskulatur, die den TVA-Muskel umgibt, einschließlich EO, IO und rectus abdominis, auch gekennzeichnet und für die NMJ-Analyse verwendet werden. Für eine umfassende Analyse der NMJ-Pathologie in einem Mausmodell ist es wichtig, eine Reihe von Muskeln im ganzen Körper zu berücksichtigen und die Analyse nicht auf einen einzelnen Muskel zu beschränken. Dies wird in Mausmodellen von motorischen Neuronenerkrankungen veranschaulicht, bei denen es eine signifikante Heterogenität in den Niveaus der NMJ-Pathologie zwischen verschiedenen Muskeln20gibt. Eine solche intermuskuläre Variabilität ist ein äußerst wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung des Mechanismus der Motorneuron-Schwachstelle und daher könnte die Beschränkung der Analyse auf einen einzelnen Muskel das Potenzial der Forschung erheblich verringern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Canadian Institutes of Health Research (Grant-Nummer MOP 38040) an R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) an R.K., Families of SMA to R.K. und L.M.M, The SMA Trust to T.H.G. und The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G. unterstützt. L.M.M ist Empfänger eines Multiple-Sklerose-Gesellschafts-Postdoktorandenstipendiums der Multiple Sclerosis Society of Canada und R.K. ist Empfänger eines University Health Research Chair von der University of Ottawa.
Materials
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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