تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل
Summary
في هذا الفيديو نظهر بروتوكولا لتشريح العضلات abdominis عرضية من الماوس واستخدام immunofluorescence والمجهر لتصور تقاطعات العصبية والعضلية.
Abstract
تحليل مورفولوجيا تقاطع العصبية والعضلية يمكن أن تعطي فكرة هامة في الحالة الفسيولوجية للخلية العصبية الحركية معينة. تحليل العضلات المسطحة رقيقة يمكن أن تقدم ميزة كبيرة على العضلات المستخدمة تقليديا سمكا, مثل تلك التي من الطرف الخلفي (على سبيل المثال. الجهاز الهضمي). تسمح العضلات الرقيقة بنظرة عامة شاملة على نمط ال الداخلي بأكمله لعضلات معينة ، مما يسمح بدوره بتحديد برك ضعيفة بشكل انتقائي من الخلايا العصبية الحركية. تسمح هذه العضلات أيضا بتحليل المعلمات مثل حجم وحدة المحرك ، والمتفرعة المحورية ، والنهاية / العقدية تنبت. وثمة عقبة شائعة في استخدام هذه العضلات هو اكتساب الخبرة التقنية لتشريح لهم. في هذا الفيديو، نقوم بتفصيل بروتوكول تشريح عضلة abdominis (TVA) العرضية من الفئران الصغيرة وأداء الفلورسينس المناعي لتصور المحاور والتقاطعات العصبية العضلية (NMJs). ونحن نثبت أن هذه التقنية يعطي لمحة كاملة عن نمط ال الداخلي للعضلات TVA ويمكن استخدامها للتحقيق في علم الأمراض NMJ في نموذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة, ضمور العضلات الشوكي.
Introduction
تقاطعات العصبية والعضلية (NMJs) هي اتصال متشابك بين الخلايا العصبية الحركية السفلية وألياف العضلات الهيكل العظمي. وهي تعتبر تقليديا المشبك الثلاثي, تتكون من الخلايا العصبية (محطة presynaptic), الألياف العضلية (محطة ما بعد متشابك), ومحطة شوانالخلية 1. NMJs ويبدو أن الأهداف المبكرة والكبيرة في علم الأمراض في مجموعة من أمراض الخلايا العصبية الحركية ونماذج الماوس2,3. وتشمل الأعراض النموذجية denervation, حيث يصبح نهاية المحرك خالية من التعصيب presynaptic, تورم في محطة presynaptic, وانخفاض في تعقيد مورفولوجيا NMJ4-11. ويمكن أيضا أن يلاحظ الاستجابات التعويضية، والتي تشمل محطة ونودال تنبت، حيث تمتد العمليات المحورية من المحطات متشابك المتبقية أو internodes إلى لوحات النهاية denervated إعادة تنشيط12،13. نظرا للارتباط الوثيق بين النشاط المتشابك ومورفولوجيا NMJ ، يمكن الحصول على قدر كبير من المعلومات حول الحالة الوظيفية للخلايا العصبية الحركية من تحليل مورفولوجيا NMJ. كما فقدان NMJs يمثل في كثير من الأحيان واحدة من الجوانب الأولى من علم الأمراض العصبية والعضلية4,10, يمكن أن يعطي القياس الكمي على مستوى التدخيل معلومات هامة حول تطور علم الأمراض والتأثير المحتمل للتدخل العلاجي. وعلاوة على ذلك، كما فقدان NMJ يمثل خطوة هامة في التقدم المرضي، وتطوير العلاجات التي يمكن أن استقرار الاتصالات وتشجيع التجديد قد تسفر عن فائدة كبيرة.
عند تحليل مورفولوجيا NMJ ، فإن اختيار العضلات له أهمية كبيرة. قد تتضمن بعض الاعتبارات الأولية نوع ألياف العضلات، ووضع الجسم، والتحليل المقارن للظروف البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، عندما تكون هناك حاجة إلى تلاعب مثل حقن المواد أو إصابات الأعصاب الرضية، من المهم أيضا النظر في إمكانية الوصول التجريبي. بشكل عام، فمن الأفضل لتحليل مجموعة من العضلات المتمركزة في جميع أنحاء الجسم مما يعكس مجموعة من الأنواع الفرعية وحدة المحرك. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، يتأثر اختيار العضلات من سهولة تشريح. وبالتالي، غالبا ما يتم إجراء تحليل NMJ حصرا على العضلات الزائدة الدودية الكبيرة مثل gastrocnemius. للحصول على تلطيخ NMJ جيدة في مثل هذه العضلات، والقسم أو تعطيل ميكانيكي من ألياف العضلات وغالبا ما تكون هناك حاجة. ونتيجة لذلك، قد يصبح نمط التعصيب معطلا وغالبا ما يتعرض تحليل شامل وعالي الجودة لأنماط التعصيب وتنتشر وتنبت. نهج بديل هو استخدام العضلات المسطحة رقيقة التي لا تتطلب تقسيم ويمكن أن تكون ملطخة وشنت سليمة، مما يسمح لمحة شاملة عن ال داخل العضلات بأكملها. هناك عدد من العضلات التي يمكن استخدامها لمثل هذا التحليل، بما في ذلك مجموعة من العضلات القحفية، (تشمل levator أوريس لونغوس، العورة متفوقة، وauris أوريس لونغوس adductor)14، عضلات الصدر (على سبيل المثال. الثلاثي ستيرني) 15, والبطن (على سبيل المثال، عرضية abdominis (TVA)) العضلات. العائق الرئيسي في استخدام هذه العضلات هو الخبرة التقنية اللازمة لتشريحها دون ضرر.
في هذا الفيديو، ونحن نقدم بروتوكولا لتشريح وأداء وضع العلامات immunofluorescent من العضلات TVA من الماوس للسماح بتحليل شامل لنمط ال الداخلي ومورفولوجيا NMJ. عضلة TVA هي عضلة ارتعاش بطيئة في الغالب تتألف من أعمق طبقة من عضلات البطن ويتم تنشيطها من قبل الأعصاب الوربية السفلية. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن تكون باستمرار عرضة للغاية لعلم الأمراض في عدد من نماذج الماوس من مرض الخلايا العصبية الحركية في مرحلة الطفولة ضمور العضلات الشوكي (SMA) وفي نماذج الماوس الأخرى من انحطاط الخلايا العصبية الحركية بداية مبكرة4,16. لذلك نقترح أن TVA هو عضلة مفيدة لإجراء تحليل NMJ في الأمراض العصبية الطرفية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا الفيديو، قمنا بتفصيل بروتوكول لتشريح عضلة TVA من الماوس ووضع العلامات المناعية الكاملة ل NMJs داخل العضلات. كما نقدم بيانات تظهر أن هذه العضلة يمكن استخدامها لتحليل أمراض التقاطع العصبي العضلي في نموذج الماوس من SMA.
يعتمد النجاح في هذه التقنية على عدد من العوامل. وفيما يلي بعض المشاكل الأكثر شيوعا. أولا: ضعف التلطيخ المناعي الكيميائي. يمكن أن يكون هناك عدد من الأسباب لذلك، واحدة من أكثر شيوعا هو استخدام الكواشف المختلفة لتلك المذكورة في هذا البروتوكول. من المهم جدا أن يكون الفحص المجهري الإلكتروني عالي الجودة PFA مهما جدا لضمان تلطيخ جيد ، وكذلك اختيار الأجسام المضادة المدرجة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، في الحيوانات القديمة(أي> 3 أشهر) ، يمكن أن يكون الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة أكثر صعوبة. وذلك بسبب زيادة سمك اللفافة المحيطة العضلات وزيادة في تراكم الدهون بين المائل الخارجي وdbdominis tranversus. من المهم تجريد الدهون، قبل الشروع في immunofluorescence. قد يكون من الضروري أيضا لتجريد قبالة بعض اللفافة التي تغطي العضلات، والتي يمكن أن تصبح سميكة. من الصعب في بعض الأحيان تجريد اللفافة والدهون من العضلات دون تكبد بعض الأضرار التي لحقت ألياف العضلات وتعطيل نمط التعصيب. ولكن إذا تم تنفيذ هذه التقنية بعناية ، يمكن الحصول على تلطيخ ذات نوعية جيدة من الفئران حتى 1 سنة على الأقل من العمر. في الفئران الأصغر سنا(أيأقل من 3 أشهر من العمر) لا ينبغي أن يكون من الضروري إجراء أي إغاظة أو فصل ألياف العضلات. ثانيا: صعوبة في العثور على NMJs بعد تشريح وتلطيخ. هذا غالبا لأن تشريح لم تمتد تحت الضلع الأخير. وتقع غالبية NMJs فقط تحت الضلع الأخير، وبالتالي يجب توخي الحذر لضمان إدراج هذا الجزء من العضلات في تشريح. ثالثا: التزام عضلة EO بعضلات TVA. غالبا ما تكون هذه شكوى عندما يحاول الأفراد تمديد التشريح إلى ما دون مستوى العضلة المائلة الداخلية (IO). منطقة العضلات TVA حيث IO موجود أيضا هو أكثر صعوبة لتحليل كما يمكن أن يكون من الصعب التمييز بين العضلات التي هي. لهذا السبب، ونحن بشكل روتيني مجرد تشريح الجزء الأكثر تفوقا من العضلات TVA. وعلى هذا المستوى، لا يوجد أي التزام بين عضلات منظمة أصحاب العمل وقوة التلفزيون، وبالتالي لا ينبغي أن يكون ذلك مشكلة كبيرة.
أحد العوائق الهامة لاستخدام عضلة TVA ، مقارنة بالعضلات الزائدة الدودية ، هو إمكانية الوصول إما للتلاعب الجراحي أو حقن المواد. يمكن أن تكون هذه الأنواع من التجارب حاسمة للتحقيق في فسيولوجيا NMJ في عضلة معينة. على الرغم من أن TVA هو بالتأكيد أقل سهولة الوصول إليها من العضلات الأكثر شيوعا مثل الساق الأمامي أو gastrocnemius, وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه من الممكن ل denervate TVA عن طريق الإصابة الجراحية للأعصاب الوربي18. وقد استخدمنا مؤخرا أيضا هذه العضلة للإدارة المحلية للمواد تحت التخدير العام (بيانات غير منشورة). على الرغم من أن هذه التجارب يمكن أن تمثل تحديا تقنيا معتدلا، وهذا العمل يدل على أنها ممكنة وبالتالي توسيع فائدة هذه العضلة لتحليل NMJs تحت كل من التلاعب المرضي والفسيولوجي.
العضلات TVA هي واحدة من عدد من العضلات المسطحة رقيقة تقع في جميع أنحاء الجسم التي يمكن استخدامها لتحليل كامل جبل من أنماط ال الداخلي. وتشمل العضلات الأخرى مجموعة من العضلات القحفية التي تقحمها الخلايا العصبية الحركية الناشئة من نواة الوجه في جذع الدماغ ، وتشمل ليفاتور أوريس لونغوس، متفوقة المسالك ، وuctor auris longus، التشريحات التي تم وصفها سابقا14،19. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تسمية العضلات المحيطة عضلة TVA، بما في ذلك EO، IO، و rectus abdominis،واستخدامها لتحليل NMJ. للتحليل الشامل لأمراض NMJ في نموذج الماوس ، من المهم النظر في عدد من العضلات الموجودة في جميع أنحاء الجسم وعدم تقييد التحليل إلى عضلة واحدة. ويتجلى هذا في نماذج الماوس من أمراض الخلايا العصبية الحركية حيث يوجد عدم تجانس كبير في مستويات أمراض NMJ بين عضلات مختلفة20. مثل هذا التباين العضلي هو أداة قيمة للغاية عند التحقيق في آلية ضعف الخلايا العصبية الحركية وبالتالي تقييد التحليل إلى عضلة واحدة يمكن أن يقلل بشكل كبير من إمكانات البحث.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (منحة رقم MOP 38040) إلى R.K. ، وجمعية ضمور العضلات (الولايات المتحدة الأمريكية) إلى R.K. ، وأسر SMA إلى R.K. و L.M.M ، وSMA Trust إلى T.H.G. ، وحملة ضمور العضلات إلى T.H.G. L.M.M هو حاصل على زمالة التصلب المتعدد في كندا ما بعد الدكتوراه، وR.K. هو حاصل على كرسي البحوث الصحية الجامعية من جامعة أوتاوا.
Materials
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
