Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis
Summary
In deze video demonstreren we een protocol voor dissectie van de transversus abdominis spier van de muis en gebruiken we immunofluorescentie en microscopie om neuromusculaire verbindingen te visualiseren.
Abstract
Analyse van neuromusculaire junction morfologie kan belangrijk inzicht geven in de fysiologische status van een bepaald motorneuron. Analyse van dunne platte spieren kan een aanzienlijk voordeel bieden ten opzichte van traditioneel gebruikte dikkere spieren, zoals die van de achterpoot (bijv.. gastrocnemius). Dunne spieren zorgen voor een uitgebreid overzicht van het hele innervatiepatroon voor een bepaalde spier, wat op zijn beurt identificatie van selectief kwetsbare pools van motorneuronen mogelijk maakt. Deze spieren maken ook analyse van parameters mogelijk, zoals de grootte van de motorische eenheid, axonale vertakking en terminale / nodale kieming. Een veel voorkomend obstakel bij het gebruik van dergelijke spieren is het verkrijgen van de technische expertise om ze te ontleden. In deze video beschrijven we het protocol voor het ontleden van de transversus abdominis (TVA) spier van jonge muizen en het uitvoeren van immunofluorescentie om axonen en neuromusculaire verbindingen (NMJ’s) te visualiseren. We tonen aan dat deze techniek een volledig overzicht geeft van het innervatiepatroon van de TVA-spier en kan worden gebruikt om NMJ-pathologie te onderzoeken in een muismodel van de motorneuronziekte bij kinderen, spinale musculaire atrofie.
Introduction
Neuromusculaire verbindingen (NMJ’s) zijn de synaptische verbinding tussen een lager motorneuron en een skeletspiervezel. Ze worden traditioneel beschouwd als een tripartiete synaps, bestaande uit een neuron (presynaptische terminal), spiervezel (post synaptische terminale) en terminale Schwann cel1. NMJ’s lijken vroege en significante doelwitten in pathologie te zijn in een reeks motorneuronziekten en muismodellen2,3. Typische symptomen zijn denervatie, waarbij de motorische eindplaat verstoken raakt van een presynaptische innervatie, zwelling van de presynaptische terminal en een vermindering van de complexiteit van de NMJ-morfologie4-11. Compenserende reacties kunnen ook worden opgemerkt, waaronder terminale en nodale kieming, waarbij axonale processen zich uitstrekken van resterende synaptische terminals of internodes tot gerenervateerde gedenervateerde eindplaten12,13. Door de nauwe correlatie tussen synaptische activiteit en NMJ-morfologie kan veel informatie worden verkregen over de functionele status van motorneuronen uit analyse van NMJ-morfologie. Aangezien verlies van NMJ’s vaak een van de eerste aspecten van neuromusculaire pathologie4,10vertegenwoordigt, kan kwantificering op het niveau van innervatie belangrijke informatie geven over de progressie van pathologie en het potentiële effect van een therapeutische interventie. Bovendien, aangezien NMJ-verlies een belangrijke stap in pathologische progressie betekent, kan de ontwikkeling van therapieën die verbindingen kunnen stabiliseren en regeneratie kunnen aanmoedigen, aanzienlijke voordelen opleveren.
Bij het analyseren van NMJ morfologie is spierkeuze van groot belang. Enkele van de belangrijkste overwegingen kunnen spiervezeltype, lichaamspositie en vergelijkende analyse van menselijke omstandigheden zijn. Bovendien, waar manipulaties zoals injectie van stoffen of traumatisch zenuwletsel nodig zijn, is experimentele toegankelijkheid ook belangrijk om te overwegen. Over het algemeen verdient het de voorkeur om een reeks spieren te analyseren die door het hele lichaam zijn geplaatst en een reeks subtypen van de motorische eenheid weerspiegelen. Vaak wordt de spierkeuze echter beïnvloed door het gemak van dissectie. Bijgevolg wordt NMJ-analyse vaak uitsluitend uitgevoerd op grote appendiculaire spieren zoals gastrocnemius. Om een goede NMJ-kleuring in dergelijke spieren te verkrijgen, is vaak sectioning of mechanische verstoring van spiervezels vereist. Als gevolg hiervan kan het innervatiepatroon worden verstoord en wordt een uitgebreide en hoogwaardige analyse van innervatiepatronen, ontkiemen en denervatie vaak aangetast. Een alternatieve aanpak is om dunne platte spieren te gebruiken die geen doorsnede vereisen en intact kunnen worden gekleurd en gemonteerd, waardoor een uitgebreid overzicht van de volledige innervatie van de spier mogelijk is. Er zijn een aantal spieren die voor een dergelijke analyse kunnen worden gebruikt, waaronder een groep schedelspieren ( triangularis sterni) enbuikspieren(bijv. transversus abdominis (TVA)). De grootste belemmering bij het gebruik van dergelijke spieren is de technische expertise die nodig is om ze zonder schade te ontleden.
In deze video bieden we een protocol om immunofluorescente etikettering van de TVA-spier van de muis te ontleden en uit te voeren om een uitgebreide analyse van het innervatiepatroon en nmj-morfologie mogelijk te maken. De TVA-spier is een overwegend langzame twitch-spier die de diepste laag buikspieren omvat en wordt geïntensierd door de onderste intercostale zenuwen. Eerder werk heeft aangetoond dat het consistent zeer kwetsbaar is voor pathologie in een aantal muismodellen van de kindermotorneuronziekte spinale musculaire atrofie (SMA) en in andere muismodellen van vroege beginnende motorneurondegeneratie4,16. We stellen daarom voor dat de TVA een nuttige spier is voor het uitvoeren van NMJ-analyse bij perifere neuropathieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze video hebben we een protocol beschreven voor de dissectie van de TVA-spier van de muis en voor de immunofluorescente etikettering van NMJ’s in de spier. We presenteren ook gegevens waaruit blijkt dat deze spier kan worden gebruikt om neuromusculaire junction pathologie te analyseren in een muismodel van SMA.
Succes in deze techniek is afhankelijk van een aantal factoren. Enkele van de meest voorkomende problemen worden hieronder beschreven. Ten eerste: slechte immunohistochemische kleuring. Er kunnen een aantal redenen voor zijn, een van de meest voorkomende is het gebruik van verschillende reagentia dan die vermeld in dit protocol. Een hoogwaardige elektronenmicroscopiekwaliteit PFA is erg belangrijk om een goede kleuring te garanderen, net als de keuze van antilichamen die in dit protocol worden vermeld. Bovendien kan het bij oudere dieren(d.w.z.> 3 maanden) moeilijker zijn om vlekken van goede kwaliteit te krijgen. Dit komt door de toegenomen dikte van de fascia rond de spier en de toename van vetophoping tussen de uitwendige schuine en tranversus abdominis. Het is belangrijk om het vet af te verwijderen, voordat u doorgaat met immunofluorescentie. Het kan ook nodig zijn om een deel van de fascia die de spier bedekt, die verdikt kan raken, af te kleden. Het is soms moeilijk om de fascia en het vet uit de spier te verwijderen zonder enige schade aan de spiervezel en een verstoring van het innervatiepatroon op te lopen. Als deze techniek echter zorgvuldig wordt uitgevoerd, kan kleuring van goede kwaliteit worden verkregen bij muizen tot ten minste 1 jaar oud. Bij jongere muizen(d.w.z.jonger dan 3 maanden) hoeft het niet nodig te zijn om spiervezels te plagen of te scheiden. Ten tweede: moeilijk bij het vinden van NMJ’s na dissectie en kleuring. Dit komt vaak omdat de dissectie zich niet heeft uitgebreid onder de laatste rib. De meeste NMJ’s bevinden zich net onder de laatste rib en daarom moet ervoor worden gezorgd dat dit deel van de spier in de dissectie wordt opgenomen. Ten derde: aanhankelijkheid van de EO-spier aan de TVA-spier. Dit is vaak een klacht wanneer individuen proberen de dissectie uit te breiden tot onder het niveau van de interne schuine (IO) spier. Het gebied van de TVA-spier waar de IO ook aanwezig is, is moeilijker te analyseren omdat het moeilijk kan zijn om te onderscheiden welke spier welke is. Om deze reden ontleden we routinematig gewoon het meest superieure deel van de TVA-spier. Op dit niveau is er geen aanhankelijkheid tussen de EO- en TVA-spieren, en daarom zou dit geen significant probleem moeten zijn.
Een belangrijke belemmering voor het gebruik van de TVA-spier, in vergelijking met appendiculaire spieren, is toegankelijkheid voor chirurgische manipulaties of injectie van stoffen. Dit soort experimenten kunnen cruciaal zijn om nmj fysiologie in een bepaalde spier te onderzoeken. Hoewel de TVA zeker minder gemakkelijk toegankelijk is dan meer gebruikte spieren zoals tibialis anterior of gastrocnemius, heeft eerder werk aangetoond dat het mogelijk is om de TVA te denerveren door chirurgisch letsel van de intercostale zenuwen18. We hebben deze spier onlangs ook gebruikt voor lokale toediening van stoffen onder algemene verdoving (niet-gepubliceerde gegevens). Hoewel deze experimenten een matige technische uitdaging kunnen vormen, toont dit werk aan dat ze haalbaar zijn en zo het nut van deze spier uitbreiden voor analyse van NMJ’s onder zowel pathologische als fysiologische manipulatie.
De TVA-spier is een van een aantal dunne platte spieren in het hele lichaam die kunnen worden gebruikt voor de analyse van innervatiepatronen. Andere spieren omvatten een groep schedelspieren die zijn geïntenseerd door motorneuronen afkomstig van de gezichtskern van de hersenstam, waaronder levator auris longus, auricularis superior, en adductor auris longus, waarvan de dissecties eerder zijn beschreven14,19. Bovendien kan het spierstelsel rond de TVA-spier, inclusief EO, IO en rectus abdominis,ook worden gelabeld en gebruikt voor NMJ-analyse. Voor een uitgebreide analyse van NMJ-pathologie in een muismodel is het belangrijk om een aantal spieren in het hele lichaam te overwegen en de analyse niet te beperken tot één spier. Dit wordt geïllustreerd in muismodellen van motorneuronziekten waarbij er een significante heterogeniteit is in niveaus van NMJ-pathologie tussen verschillende spieren20. Een dergelijke intermusculaire variabiliteit is een uiterst waardevol hulpmiddel bij het onderzoeken van het mechanisme van de kwetsbaarheid van motorneuronen en daarom kan het beperken van de analyse tot een enkele spier het potentieel van het onderzoek aanzienlijk verminderen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadian Institutes of Health Research (subsidienummer MOP 38040) aan R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) aan R.K., Families of SMA aan R.K. en L.M.M, The SMA Trust aan T.H.G., en The Muscular Dystrophy Campaign aan T.H.G.. L.M.M is een ontvanger van een Multiple Sclerose Society of Canada Postdoctoral Fellowship, en R.K. is een ontvanger van een University Health Research Chair van de Universiteit van Ottawa.
Materials
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Dupuis, L., Loeffler, J. P. Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).
- Kariya, S., et al. Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).
- Iguchi, Y., et al. Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration. Brain. 136, 1371-1382 (2013).
- Martinez-Hernandez, R., et al. Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development. J. Pathol. 229, 49-61 (2013).
- Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy. Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).
- Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1). Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).
- Ang, E. T., et al. Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).
- Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. J. Vis. Exp. (4460), (2013).
- Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology. J. Anat. 213, 633-645 (2008).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).
- Comley, L. H., et al. ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system. Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).
