JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

التنميط محتويات Triacylglyceride في بات غلافي الدهون بواسطة التحليل اللوني طبقة رقيقة محضرة وMALDI-TOF الطيف الكتلي

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

إهاب الثدييات يحتوي على الدهون القابلة للاستخراج المذيبات التي يمكن أن توفر التراكيب الكيميائية المميزة من الأنواع الفردية. تعرض هذه الورقة طريقة روتينية لفصل الطبقات الشحمية واسعة معزولة عن الأنسجة غلافي باستخدام طبقة رقيقة اللوني وتحديد الشخصى triacylglyceride بواسطة بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة.

Abstract

يتضمن إهاب الثدييات الغدد الدهنية التي تفرز مادة دهنية على سطح البشرة. إنتاج الزهم هو جزء من نظام المناعة الفطري الذي هو وقائي ضد الميكروبات المسببة للأمراض. إنتاج الزهم غير طبيعي والتركيب الكيميائي هي أيضا من أعراض سريرية لأمراض الجلد محددة. يحتوي الزهم خليط معقد من الدهون، بما في ذلك triacylglycerides، وهو أنواع محددة. الخصائص الكيميائية واسعة عرضت من قبل الطبقات الدهنية المتنوعة تعيق تقرير محددة من تكوين الزهم. التقنيات التحليلية لنسبة الدهون عادة ما تتطلب derivatizations الكيميائية التي هي زيادة تكاليف إعداد عينة كثيفة العمالة و. وتصف هذه الورقة كيفية استخراج الدهون من إهاب الثدييات، والطبقات الدهنية واسعة منفصلة من قبل طبقة رقيقة اللوني، وملف محتويات triacylglyceride باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة. هذا الأسلوب قوية تمكن تقرير المباشرةمن ملامح triacylglyceride بين الأنواع والأفراد، ويمكن تطبيقه بسهولة إلى أي مجموعة تصنيفية من الثدييات.

Introduction

وتشمل الأنسجة غلافي الثدييات البشرة، والهياكل كيراتينية (مثل الشعر والأظافر)، والغدد الإفرازية. ترتبط الغدد الدهنية من نوع إفرازات مع بصيلات الشعر، والتي يشار إليها مجتمعة ب الوحدة الشعرية الدهنية 1. الغدد الزهمية الافراج عن الافرازات الدهنية على سطح الجلد ويشار إلى الزهم. وتتألف إلى حد كبير من الزهم glycerolipids (على سبيل المثال triacylglycerides [الكلمات])، acyls الدهنية الحرة (FFAs)، استرات ستيرول / الشمع، والسكوالين. التركيب الكيميائي الزهم هو أنواع محددة 2. بالإضافة إلى كونها جزءا من نظام المناعة الفطرية وتوفير وظيفة مضادة للميكروبات 3، والدهون الدهنية تؤثر على العمليات الفسيولوجية الهامة بما في ذلك فقدان الماء من خلال التبخر الجلد 4، سلامة الخلوية وتنظيم الجينات 5، وامتصاص الدواء 6. يمكن تركيبة الدهون الدهنية أيضا بمثابة علامات المرض. نسب وكميات الدهنية ب تغييرالطبقات الدهنية الطريق هي علامات سريرية من الأمراض مثل حب الشباب الشائع 7، 8 القشرة والتهاب الجلد الدهني 8، 9 ندرة الزهم، من بين أمور أخرى 10. وتشمل الأنسجة البشرة والشعر ملامح متغير يحتوي ستيرول ومشتقاتها، والعلامات، FFAs، سيراميد، الدهون الفوسفاتية، وغيرها من مكونات الدهون طفيفة. لأن الدهون غلافي يمكن أن تعمل في عمليات المرض، وتحديد الاختلافات في التراكيب الكيميائية من الكلمات بين الأفراد الأصحاء والمرضى قد تكون مفيدة للتشخيص السريري للمرض.

وتعرف عموما بأنها الدهون مركبات عضوية غير قابلة للذوبان في الماء مع بدائل إما غير القطبية أو غير القطبية القطبية 11. قد تكون الهياكل الدهون سلاسل طويلة الهيدروكربونية، الألكانات الاوكسيجين (بما في ذلك استرات الشمع، FFAs، والكحول، الكيتونات، الألدهيدات و)، أو هياكل حلقة معقدة مثل الكوليسترول 12. هناك ثمانية فئات رئيسية من الدهون على أساس هيكل (FFAs، glycerolipiس [GL]، glycerophospholipids [GP]، الدهون الإسفنجية [SP]، والدهون ستيرول [ST]، والدهون prenol [PR]، saccharolipids [SL]، وpolyketides [PK])، والتي تظهر مجموعة واسعة من الخصائص الكيميائية تبعا ل الدرجة 13. ويرجع ذلك إلى تباين واسع في الخصائص الكيميائية للفئات الدهون، هو المطلوب التنميط مباشرة دون اشتقاق مسبقة من جزيئات الدهون. أسلوب واحد الناشئة في مجال البحوث الدهون هو طبقة رقيقة اللوني (TLC) جنبا إلى جنب مع بمساعدة مصفوفة الامتزاز الليزر / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة (MS MALDI-TOF) 14.

يستخدم MALDI-TOF MS على نطاق واسع في مجال البحوث البروتين لتحديد البروتينات وربطها على سلاسل الأحماض الأمينية محددة نظرا لالببتيد أيون الشامل "بصمات الأصابع" درجة عالية من الدقة ولدت من هضم البروتينات التربسين 15. ويمكن أيضا MALDI-TOF MS استخدامها لملف الطبقات جزيء حيوي الأخرى، بما في ذلك الدهون مثل العلامات 16-18. يتطلب MALDI استخدام مصفوفة، الطباعically مركب عضوي يحتوي على هياكل الرابطة المزدوجة العطرية ومترافق. جزيئات المصفوفة خدمة لنقل بلطف طاقة الليزر إلى التحاليل، وتعزيز نقل بروتون، وإنتاج الأيونات المشحونة منفردة طور الغاز 19-21. تخضع الأيونات إلى حقل عالية الجهد تحت فراغ عالية وتسارع إلى محلل الشامل TOF حيث يتم فصل الأيونات في وقت لاحق من خلال أوجه الاختلاف في السرعات التي تتناسب مع هذه النسب الشامل إلى تهمة. يمكن المتأينة حتى الجزيئات الحيوية الكبيرة جدا مع تجزئة قليلا، وتنتج الأنواع أيون الجزيئية اتهم منفردة لتحليل الطيف مبسطة. عززت القدرة على تحليل جزيئات الدهون مباشرة دون اشتقاق قبل اعتماد استعداد للMALDI-TOF MS في مجال البحوث lipidomic 18.

تعرض هذه الورقة طريقة روتينية لعزل وتحليل الدهون غلافي من الشعر، والإفرازات الدهنية وplagiopatagium من الخفافيش الحمراء الشرقية (Lasiurus borealiق). ويستخدم هذا لتحديد الاختلافات بين الأنواع في الخفافيش الدهون غلافي لتوضيح عملية مرض متلازمة الأنف الأبيض (WNS) 22. WNS هو مرض فطري من الخفافيش وتسببه الأنواع قري وصفها حديثا Geomyces destructans 23-25. وقد تسبب WNS وفاة أكثر من 5 ملايين الخفافيش كهف أمريكا الشمالية ويهدد بانقراض أنواع الخفافيش الضعيفة، مع الآثار الاقتصادية المحتملة لمليارات الدولارات من الأضرار التي لحقت القطاع الزراعي 26،27. للتحقيق الخطوات في G. destructans العدوى، تم استخراج الدهون من الشعر والجناح الأنسجة من الخفافيش الحمراء الشرقية وفصلها إلى طبقات الدهن واسعة من قبل TLC لعزل جزء TAG لتحليلها لاحقا من قبل MALDI-TOF MS. الكلمات تحتوي على سلاسل أسيل قصيرة ويتم الكشف عنها بسهولة من قبل MALDI-TOF MS مع التدخل مصفوفة قليلا.

Protocol

تنبيه: الحصول مقدما عن الدولة الاتحادية والتصاريح اللازمة لمناولة ونقل وتخزين الخفافيش. كما يجب الحصول على موافقات من لجنتكم المؤسسية رعاية الحيوان والاستخدام، وكذلك من لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية الخاصة بك. إذا الخفافيش حية (أو أنسجة الجهاز العصبي) هي ليتم التعامل معها، وينبغي تطعيم المتعاملين مع الحيوانات لداء الكلب. جمعت الخفافيش التي استخدمت في الدراسة الحالية من أوزارك القديس فرنسيس الوطنية للغابات، AR، خلال صيف عام 2010 وفقا للأساليب المعيارية (جامعة ولاية أركنساس في لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية موافقة # 135349-1) 28. 1. النسيج العلاج واستخراج الدهن تنظيف جميع الصكوك مع الميثانول قبل وبين جمع الأنسجة من مختلف الأفراد. تقليم الشعر (حوالي 1.0 غرام) من الجلد مع مقص ومكان في دورق مخروطي سعة 125 مل. الزهم عينة من سطح الجناح عن طريق تنقية الجلد مع 4-6 كرات القطن المبللة مع الكلوروفورم: الميثانول المذيبات (C: M؛ 03:02 ت / ت)، ووضع هذه في قارورة منفصلة. استخراج الأنسجة مع 10 مل من C: M (2:1 ت / ت) تحتوي على 0.5٪ hydroxytoluene الأنيسول (BHT) لمنع أكسدة 29. فقط استخدام المذيبات HPLC الجودة. بعد 2 ساعة، إضافة حوالي 0.5 غرام كبريتات اللامائية إلى كل قارورة، مزيج لفترة وجيزة، وجمع المذيب عن طريق الترشيح من خلال ورق الترشيح. كرر الخطوات من 1.2 و 1.3 ضعف. مرة واحدة مع 1:01 C: M وبالتتابع مع 1:02 C: M. تجمع الرواشح معا. تتبخر الرواشح المجمعة تحت تيار من N 2، وتحديد الوزن الجاف، وتذوب بقايا الدهون في 3:02 C: M (مع 0.5٪ BHT) إلى تركيز 10 ملغ / مل. عينة تخزينها في قارورة زجاجية في -20 درجة مئوية. ومن المسلم به عموما افضل لتحليل العينات في غضون شهر واحد بعد جمع العينات وتقليل تجميد أذاب دورات. 2. فصل الدهون عن طريق محضرة رقيقة طبقة اللوني إعداد مقدما غسلها المذيب 1.5 مل microceأنابيب ntrifuge عن طريق ملء مع 3:02 C: M، الشطف مع الأسيتون، وتجفيف الهواء. يتم ذلك لإزالة المواد البلاستيكية التي يمكن أن تتداخل مع تحليل الطيف الكتلي في وقت لاحق. تخزين أنابيب العينات في حاوية خالية من الغبار والتعامل مع هذه الأنابيب فقط مع قفازات لمنع التلوث من زيوت الجلد. تفعيل لوحة TLC قبل الأول قبل تطويره مع 3:02 C: M. إضافة ما يكفي من المذيبات إلى غرفة TLC على عمق 1 سم، ثم وضع لوحة في غرفة (وثيقة مع غطاء زجاجي) والسماح للمذيب لتشغيل تماما إلى الجزء العلوي من لوحة. وهذا يستغرق حوالي 45 دقيقة. إزالة لوحة والجافة في غطاء الدخان حتى يتبخر المذيب (حوالي 15 دقيقة)، ثم وضع في الفرن لمدة 10 دقيقة على الأقل في 120 درجة مئوية. وضع علامة قلم رصاص في الجزء العلوي من لوحة للحفاظ على التوجه عندما يتم تطبيق العينات. وضع خط قلم رصاص على التوالي، 1.5 سم من الحافة السفلى من لوحة، بمناسبة الأساس حيث سيتم وضع العينة والمعايير. إعداد غرفة TLC بقطعقطعة من ورق الترشيح كبيرة بما يكفي لسطرين الجدران قصيرة واحدة جدار طويل. وضع ورقة الترشيح بطانة الى غرفة. سوف رطبة تماما عند إضافته المذيب الى قاعة المحكمة. إعداد 100 مل من الطور المتحرك المذيبات، والتي هي الهكسان: ايثر: حمض الخليك (H: E: A؛ 80:20:2 ت / ت / ت). صب المذيب الى غرفة لإعطاء عمق حوالي 1 سم. تغطية مع غطاء زجاجي، وذلك باستخدام ختم سيليكون الشحوم على طول الحافة العلوية للغرفة. السماح للغرفة لكي تتوازن بين عشية وضحاها قبل الاستخدام. تطبيق نموذج يدويا على لوحة استعداد مع أنبوب شعري أو ماصة كما يشكل حلقة في سلسلة مستمرة من حوالي 1.5 سم من حافة واحدة إلى 1.5 سم من الحافة الأخرى. ويفضل عينة قضيب الآلي نظرا لأنه سيتم تحميل العينة في خط أكثر تجانسا. استخدام الممرات الخارجية للوحة TLC على الفور حوالي 20 ميكرولتر من خليط ستيرول، FFAs، والعلامات، والمعايير ستيرول استر (استخدام في 10 ملغ / مل، ويمكن الحصول على مخاليط ولم يضف). وضع لوحة TLC تحميلها فيغرفة معايرتها، وثيق مع الغطاء، ووضع لوحة حتى المذيب يركض إلى الحافة العلوية. وهذا يستغرق حوالي 45 دقيقة مع الطور المتحرك هو موضح هنا. إزالة لوحة من الغرفة وتسمح المذيب الزائدة لتتبخر من لوحة في غطاء الدخان لمدة 1 دقيقة. رذاذ مع 0.05٪ رودامين 6G في الايثانول 95٪. تصور العصابات الدهون تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة. علامة مع قلم رصاص الموقف و R للعصابات الفلورسنت حل في العينة والمعايير. ويمكن اتخاذ سجل التصوير عند هذه النقطة. تحديد الفرقة المقابلة مع معيار TAG وإزالته من لوحة عن طريق كشط قبالة السيليكا مع ملعقة على قطعة كبيرة من الورق تزن عازل. نقل السيليكا إلى 1.5 مل من المذيبات غسلها أنبوب microcentrifuge. إضافة 1.0 مل 3:2 C: M المذيبات إلى أنبوب العينة، يصوتن لمدة 1 دقيقة، بيليه السيليكا بواسطة الطرد المركزي، ومن ثم نقل المذيب في أنبوب جديد وزنه مسبقا. تكرار عشره الخطوة السابقة، تجميع الرواشح، وتتبخر المذيب تحت تيار من N 2. تخزين بقايا المجففة تحتوي على الكلمات تحت رقم 2 في الظلام في 4 درجات مئوية في حين يتم فصل عينات الأنسجة الإضافية التي TLC. رودامين 6G موجود في عينات، لكنه غير قابل للذوبان في الهكسان وتتم إزالة عينة خلال حل على الفور قبل التحليل MS. 3. تحليل TAG-TOF MALDI التي كتبها MS إعداد α-سيانو-4-هيدروكسي حمض السيناميك (CHCA) حل مصفوفة جديدة عن طريق إذابة 10 ملغ في 1 مل CHCA المذيبات (49.5٪ من الإيثانول، 49.5٪ أسيتونتريل، و 1٪ مائي 0.1٪ TFA). إعداد هرمون adrenocarticotropic (ACTH؛ 18-39 مقطع، 2465،1989 دا) لقرار الصك واختبار حساسية عن طريق خلط 1 ميكرولتر من ACTH (1 ملغ / مل) مع 39.5 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic 0.1٪ (TFA) للحصول على 10 بمول / ميكرولتر محلول المخزون. هذه يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. إعداد الطازجة العمل ACTH solutايون (1 بمول / ميكرولتر) من خلال اتخاذ 1 ميكرولتر من 10 بمول / ميكرولتر حل الأسهم، والاختلاط مع 9 ميكرولتر 0.1٪ TFA، ومن ثم خلط (1:1) مع 10 ميكرولتر من الحل مصفوفة CHCA للحصول على 500 fmol / تركيز ميكرولتر. إعداد معايير TAG في 10 ملغ / مل في 03:02 C: M لMALDI أداة معايرة (على سبيل المثال tricaprin [470،361 دا]، tricaprylin [554،455 دا]، ثلاثي اللورين [638،549 دا]، ثلاثي بالميتين [722،642 دا]، tripalmitolein [800،689 دا] ، trimyristin [806،736 دا]، ثلاثي الأولين [884،783 دا]، ثلاثي-11-eicosenoin [968،877 دا]، وtrierucin [1052.971 دا]). إعداد ثلاثي الأولين في 10 ملغ / مل في 03:02 C: M لقفل الشامل المعايرة القياسية TAG الخارجية. حل العينات المخزنة في TAG الهكسان إلى حل 10 ملغ / مل. إعداد 0.5 M (77.06 mg/1.0 مل) محلول المخزون من حمض 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) مع 90٪ الميثانول للاستخدام كما عينة والمصفوفة القياسية. إعداد أيضا 1.0 M (2.0 g/50.0 مل) حل هيدروكسيد الصوديوم. تغطية الأنبوب مع الحل DHB باستخدام الألومنيوم حرية المعلومات ل للحماية من ضوء. مزيج (في أنابيب قبل غسلها) 10.0 ميكرولتر مصفوفة DHB، 10.0 ميكرولتر عينة أو معيار، و 5.0 ميكرولتر 1.0 M هيدروكسيد الصوديوم. مزيج لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب لجلب الخليط إلى أسفل. بقعة 1.0 ميكرولتر من معيار، عينة، أو ACTH الصعود إلى MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة الهدف ومكان في مجفف حتى تجف. وضع لوحة الهدف في الصك للحصول على البيانات. أداء MALDI-TOF MS تحليل في وضع reflectron إيجابية. لحن ومعايرة الصك كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة الصك باستخدام ACTH والحلول القياسية TAG. الحصول على أطياف لكل عينة رصدت على لوحة الهدف (بما يتفق مع المواصفات الصك؛ كانت المعلمات لهذا العمل 5 هرتز معدل إطلاق الليزر، ~ 100 طلقة لكل بقعة للحصول على متوسط ​​الطيف). بعد تمهيد وطرح الخلفية من أطياف MALDI، قمم عملية أيون يدويا مع محرك بحث في الإنترنت الدهون في MAPS (/ أدوات / مللي / glycerolipids_batch "الهدف =" _blank "> www.lipidmaps.org / أدوات / مللي / glycerolipids_batch). نسخ ولصق قائمة الأطياف في قائمة السلائف والأيونات مربع شدة. قصر البحث على تكوين أسيل المطلوب. تحديد الكلمات من قبل كتلة / تهمة (م / ض) نسب من الأيونات الموجودة في الطيف لكل عينة. إذا كانت استر الميثيل الأحماض الدهنية (FAME) النسب المتاحة من منفصلة تحليل GC / MS، إضافة إلى الحصول على هذه البيانات من احتمالات الكلمات الحاضر. صك: ومطياف الكتلة المستخدمة في هذه الدراسة هي مياه MALDI مايكرو MX (مجهزة 337 نانومتر 20 هرتز N 2 ليزر). أي الشركة المصنعة MALDI صك مع القدرة الإيجابية وضع reflectron يمكن استخدامها. الإعدادات العامة المستخدمة هي الجهد النبض، 2،000 V؛ reflectron، 5،200 V؛ المصدر، 15،000 V، مع الحصول على البيانات باستخدام MassLynx البرمجيات (ver. 4.0). توفر هذه الشروط تعمل قرار كتلة أكبر من 12،000.

Representative Results

طريقة استخراج لعزل الدهون الكلية من الأنسجة التي وصفها فولك 30 هو إجراء بسيط، والتي يتم تكييفها هنا. بعد استخراج الأنسجة وتبخر المذيبات، وغالبا ما تظهر الدهون كفيلم مصفر. اللون الأصفر هو الأكثر احتمالا من الملوثات البروتين، والتي يمكن إزالتها عن طريق إجراء استخراج السائل السائل. ليست هناك حاجة هذا تجهيز العينات إضافية في هذا الإجراء لأن التحضيرية TLC يفصل جزء من هذه TAG الملوثات. إضافة جديدة كبريتات الصوديوم اللامائية في جميع مراحل الترشيح يساعد على تخفيض تلوث المياه الذي يؤثر على قرارات دقيقة من وزن الدهون. يحلل الدهون غلافي الثدييات التي كتبها التحضيرية TLC مع H: E: سوف كطور متحرك عادة حل أربعة نطاقات مميزة الموافق (بدءا من المنشأ) الجامدة، FFAs، والعلامات، واسترات ستيرول / استرات الشمع / السكوالين (الشكل 1). في بعض الأحيان عند استخدام analytiكال عالية الأداء (HP) TLC مع H: E: وهناك مرحلة الجوالة، واسترات ستيرول، استرات شمعية، والسكوالين فصل وتظهر ثلاثة نطاقات منفصلة. في ظل الظروف المستخدمة في هذه الدراسة، لا يتم فصل استرات ستيرول / شمعي. إذا كانت هذه العصابات هي من الفائدة، يمكن أن تنتقل إلى الطور المتحرك الأيزو أوكتين: إيثيل الأثير (95:5 ت / ت)، ولوحة HPTLC يمكن تحليلها عن طريق مسح قياس كثافة. ويمكن لعوامل أخرى تسبب ضعف الانفصال. وعادة ما يتم القضاء على هذه عن طريق وضع ورقة الترشيح في غرفة، وتطبيق الشحوم لختم ضيق على الغطاء، توازنه الغرفة بين عشية وضحاها، والحفاظ على غرف نظيفة TLC، للحصول على نوعية متسقة فصل TLC والبيانات. يتم عرض ممثل MALDI-TOF أطياف الشامل التي تم الحصول عليها عن الكلمات معزولة عن الخفافيش الحمراء الشرقية في الشكلين 2 و 3. تحتوي هذه الأطياف TAG القمم أيون في نطاق الشامل بين م / ض 850-910، والتي هي نموذجية للعلامات معزولة عن الثدييات غير المائيةق. إضافة هيدروكسيد الصوديوم 1.0 M يعزز اتهم منفردة نا + الأيونات التي هي أكثر استقرارا من H + الأيونات. بالإضافة إلى الاستقرار، وغياب H + K + والأيونات يزيد سهولة تحليل الطيف. م / ض 850-910 أيون قمم تتوافق مع 16:00، 18:00، 18:01، 18:02 والأنصاف FA كونها المكونة أسيل المهيمنة في الكلمات (الجدول 1). الأنصاف FA ممكن من الكلمات يمكن تحديد البداية من قبل مجموعه أيون م / ض موجودة في MALDI-TOF MS الأطياف، والاختلافات بين الأنواع والأفراد استنتاجها. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة لنسب محددة من المحتويات أسيل، ثم يجب أن تستخدم MS / MS أو اللوني الغاز (GC / MS). مزيد من المعلومات عن نسب أسيل يمكن استخلاصه من خلال مراقبة القمم في المنطقة diacylglycerides من الطيف (الشكل 4). ويتم إنتاج Diacylglycerides من تجزئة TAG في مصدر MALDI ويمكن العثور عليها في م / ض 590-650 المنطقة. ويمكن زيادة تجزئة TAG بواسطةإهمال إضافة هيدروكسيد الصوديوم 1.0 M 16. تتميز الخفافيش الحمراء الأنسجة الجناح الشرقي قبل الذروة المهيمنة في م / ض 879.7 الأنسجة والشعر مع ذروة المهيمنة في م / ض 881.8 (الشكل 2 و3 على التوالي). قمم في م / ض 907.8، 879.7، 855.7 و(POP، PPoS) ما يقرب من كثافة حتى في (~ 50٪) في أنسجة الشعر مع ذروة في الوجود ~ 853.7 40٪. تركيب التركيب العنصري الملاحظة القداس الكلمات غ + الكلمات غ + SSO C 57 H 108 O 6 911.8 OOS، LSS C 57 H 106 O 6 909.8 OOO، LnSS، ليسوتو C 57 H104 O 6 907.8 LOO، LLS C 57 H 102 O 6 905.8 LLO، OOLn C 57 H 100 O 6 903.7 LLL C 57 H 98 O 6 901.7 LLLn C 57 H 96 O 6 899.7 LLnLn C 57 H 94 O 6 897.7 LnLnLn C 57 H 92 O 6 895.7 OSP C 55 H 104 O 6 883.8 برنامج دعم سبل المعيشة، OOP، سوبو C 55 H 102 O 6 881.8 لوب، LnSP، LSPo C 55 H 100 O 6 </ الدفتيريا> 879.7 LLP، LnOP، وبو C 55 H 98 O 6 877.7 LnLP، LLPo، LnOPo C 55 H 96 O 6 875.7 LnLnP، LnLPo C 55 H 94 O 6 873.7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871.7 PPS C 53 H 102 O 6 857.8 POP، PPoS C 53 H 100 O 6 855.7 OOM، PPL، PoPoS، بوبو C 53 H 98 O 6 853.7 PPLn، PPoL، PoPoO، MyOO C 53 H 96 O 6 851.7 ماجستير، LnOM C 53 H 94 </sUB> O 6 849.7 PPP، SSLA C 51 H 98 O 6 829.7 PPPO، OSLa C 51 H 96 O 6 827.7 PPoPo، PMyO C 51 H 94 O 6 825.7 LnLnLa C 51 H 86 O 6 817.6 MMS، صفعة، PPM C 49 H 94 O 6 801.7 SLaPo، PPoM، PPMy C 49 H 92 O 6 799.7 PoPoM، OOCa C 49 H 90 O 6 797.7 MMP C 47 H 90 O 6 773.7 MMPo، OCAP C 47 H 88 O6 771.7 OCaPo C 47 H 86 O 6 769.6 MMM، PPCa، PMLa C 45 H 86 O 6 745.6 PoPCa، PoMLa C 45 H 84 O 6 743.6 PoPoCa C 45 H 82 O 6 741.6 LaLaP، MMLa، القيمة السوقية C 43 H 82 O 6 717.6 LaLaPo C 43 H 80 O 6 715.6 OO C 39 H 72 O 5 643.5 OL C 39 H 70 O 5 641.5 LL C 39 H 68 O 5 639.5 SP C 37 H 72 O 5 619.5 OP C 37 H 70 O 5 617.5 ليرة لبنانية C 37 H 68 O 5 615.5 الجدول 1. تكوين الاحماض الدهنية، وتكوين عنصري، وكتلة من النظائر adducts sodiated من triacylglycerides وdiacylglycerides. سطر = حمض اللينولينيك (18:03)، L = حمض اللينوليك (18:02)، O = حمض الأوليك (18:1)، S = حمض دهني (18:00)، P = حمض البالمتيك (16:00)، بو = حمض البالمتيوليك (16:01)، M = حمض ميريستيتش (14:00)، بلدي = حمض myristoleic (14:01) = لا اللوريك حمض (12:0)، كا = حمض الكابريك (10:0). الشكل 1. طبقة رقيقة اللوني واسعة من الطبقة فصل الدهون عن طريق الهكسان: ايثر: حمض الخليك(80:20:2 ت / ت / ت) كطور متحرك. لم حددت الفرقة بين ستيرول وFFA من قبل القياسية ولكن قد يكون الكحول الدهنية أو الشمع diester. الشكل 2. توسيع المنطقة TAG-TOF MALDI من الطيف الكتلي من الكلمات sodiated. (م / ض 700-950) من الخفافيش الحمراء الشرقية (بورياليس L.) الأنسجة الجناح قمم المحددة في م / ض 853.7 (OOM، PPL، PoPoS، بوبو) وم / ض 879.7 (لوب، LnSP، LSPo). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية . الرقم 3. توسيع المنطقة TAG-TOF MALDI من الطيف الكتلي من الكلمات sodiated (م / ض 700-950) من الخفافيش الحمراء الشرقية (بورياليس L.) الأنسجة الشعر.القمم التي تم تحديدها في م / ض 905.8 (LOO، LLS) وم / ض 907.8 (OOO، LnSS، ليسوتو). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية . الشكل 4. المنطقة DAG-TOF MALDI من الطيف الكتلي من شظايا DAG sodiated (م / ض 530-730). الأنسجة من الخفافيش الحمراء الشرقية (بورياليس L.) الجناح قمم المحددة في م / ض 643.5 (OO) وم / ض 615.5 (LP) . انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

تعرض هذه الورقة طريقة بسيطة وقوية لفصل الطبقات الشحمية واسعة معزولة عن إهاب الثدييات التي كتبها التحضيرية TLC وتحديد ملامح TAG-TOF MALDI بواسطة MS، تستغرق وقتا طويلا دون اشتقاق من جزيئات الدهون. الخطوات الحاسمة في انتاج نوعية أطياف الكلمات مع MALDI-TOF MS تشمل ما يلي: 1) استخراج الناجحة للمجمع مع الحد الأدنى من التلوث أو أكسدة؛ 2) الانفصال والعزلة كافية من قبل اللوني، و 3) عالية الدقة والدقة الشامل MALDI-TOF MS.

يوضح هذه الورقة طريقة عن طريق استخراج وفصل الدهون جزء محايدة من plagiopatagium من الخفافيش الحمراء الشرقية للحصول على TAG ملامح MS. في حين تستخدم هذه الدراسة على أنواع الخفافيش (الثدييات: Chiroptera) هذه الأساليب يمكن أن تمتد إلى دراسة الدهون غلافي من أي أنواع الثدييات. تتميز الخفافيش إهاب من خلال كونها في الغالب الكولسترول، مع كميات أقل من الكلمات، FFAs، squaلين، وستيرول / استرات الشمع. نسب الزهم الدهنية في الخفافيش تختلف عن البشر في هذا السكوالين هي موجودة بكميات منخفضة (في مقابل ما يصل إلى 16٪ في البشر)، في حين الكوليسترول يحدث في نسب أكبر (1-7٪ في البشر، ولكن 26-62٪ في الخفافيش) 22 ، 31. الشعر الإنسان تحتوي على حوالي 3٪ الكلمات، في حين تم العثور على نسب تصل إلى 28٪ في شرق الشعر الخفافيش الحمراء. استخراج عينات الدهون من الخفافيش هي مشابهة لأنواع أخرى. بينما في هذه الدراسة تستخدم كرات القطن غارقة في المذيبات لإزالة الزهم، يمكن للمرء أيضا عكس قارورة أو عينة تحتوي على أنبوب مذيب على سطح إهاب عدة مرات. المنتجات المتخصصة الشريط أيضا توفير وسائل بديلة لاستخراج الدهون السطحية 32. جزء هام من استخراج الدهون الصحيح هو للحد من التلوث من زيوت الجلد. ويتم إنجاز هذا بسهولة عن طريق الحفاظ على زجاجة الضغط مع الميثانول والرش كل الأواني الزجاجية والأواني، ومحو أواني بمنديل بين جميع العينات ويرتدي قفازات الفحص. الأكسدة سيتم منع acyls غير المشبعة و من خلال إضافة BHT، وأنها ينبغي أن تستخدم بغض النظر عن درجة الحرارة يتم تخزين العينات في.

يتطلب تحليل جزيء حيوي عادة خطوة الكروماتوغرافي إلى جزيئات منفصلة من الاهتمام من الملوثات. يستخدم TLC في هذا الأسلوب، الذي يتجنب متطلبات الأجهزة للغاز أو اللوني السائل ويتطلب أقل خبرة تقنية لتحقيق نتائج قوية وقابلة للتكرار. اعتمادا على فئة من الدهون الفائدة، ويمكن إدراج العديد من مراحل النقالة المختلفة. وعلاوة على ذلك، واستخدام لوحات HPTLC ومسح قياس كثافة يمكن استخدامها لتحقيق النتائج الكمية. في حين أن الاختلافات في أساليب TLC هي أكثر من أن تحصى هنا، وبعض مراحل المحمول شيوعا في الدهون وتشمل الكلوروفورم TLC: الميثانول: الماء لفصل الدهون الفوسفاتية والسكرية أو الأيزو أوكتين: إيثيل الأثير لفصل الدهون غير القطبية 28. من حيث فصل من فصول الكلمات الدهون الأخرى، وH: E: A ذلكيعمل نظام lvent باستمرار ويوفر نتائج قابلة للمقارنة.

ميزة أخرى لاستخدام TLC هو أن عصابات من الفائدة يمكن لمحة سريعة باستخدام MALDI-TOF MS دون اشتقاق مسبقة من التحاليل. في هذه الدراسة تتم إزالة السيليكا من لوحة TLC، ومزال الحليلة منه بواسطة صوتنة في المذيبات واللاحقة الطرد المركزي لفصل مكثف وتبخر المذيب يبلغ حجمه. بدلا من ذلك، مصفوفة يمكن تطبيقه مباشرة على العصابات الحليلة فصل على لوحات TLC ومن ثم تحليلها مباشرة من قبل MALDI-TOF MS 33. التنميط الناجحة التي قام بها MALDI-TOF MS لا تعتمد على إعداد عينة كافية والإتقان المشغل مع ضبط ومعايرة أجهزة القياس. يجب معايرة صك يوميا مع المعايير التي تغطي مجموعة والجزيئية الوزن المناسب للجزيئات من الفائدة. وينبغي أيضا أن يتأكد حساسية مناسبة والقرار (على سبيل المثال ≥ 10،000) المعداتد يوميا مع ACTH.

مكونات الدهون الدهنية الموجودة على سطح إهاب الثدييات قد تلعب دورا في الاستعمار مسببات الأمراض البكتيرية / الفطرية. ولمعرفة التركيب الكيميائي بين الأنواع والأفراد قد توفر أدلة حول عمليات الأمراض التي تصيب الإنسان والحيوانات البرية. الاختلافات بين الأفراد ضمن النوع المريضة وصحية قد تمثل علامات سريرية التي تساعد في الكشف عن المرض والتشخيص. وعلاوة على ذلك، إذا مركبات معينة التي تمنع نمو الجراثيم موجودة، وهذه يمكن تحديدها للاستخدام في علاج المرض والوقاية منه.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تقديم المساعدة من جانب سكوت Treece، كاتلين أرتير، جيريمي Ragsdell، توني LaMark جيمس، ايمي فيشر، هانا بلير، وشايان GERDES خلال تطوير أساليب المختبر. نود أن نشكر مختبر المدينة المنورة-بوليفار (لويس H. Nopo-Olazabal؛ معهد العلوم البيولوجية أركنساس) للحصول على المساعدة مع TLC مسح قياس كثافة. MALDI-TOF MS المستخدمة في هذا المشروع وقدمت من خلال جبهة الخلاص الوطني EPSCoR، RII: مركز مبادرة الأصول أركنساس P3 (EPS-0701890) في معهد العلوم البيولوجية ولاية اركنسو. تم توفير التمويل من قبل الثروة السمكية والحياة البرية الأمريكية خدمة / ولاية أركنساس الحياة البرية غرانت، والجمعية الوطنية للكهوف، ومركز أمريكا الشمالية بات البحوث والحفظ في جامعة ولاية إنديانا.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image