JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Profilierung der Triacylglycerid Inhalt in Bat Integumentary Lipide durch präparative Dünnschicht-Chromatographie und MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

Säugetier-Hülle enthält Lösungsmittel extrahierbaren Lipide, die chemischen Zusammensetzungen der einzelnen Arten charakteristisch bieten kann. Dieser Beitrag stellt eine Routinemethode zur Trennung breiten Lipidklassen aus Integumentary Geweben isoliert mit Dünnschicht-Chromatographie und Bestimmung der Triacylglycerid Profil von Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie.

Abstract

Das Säugetier-Hülle enthält Talgdrüsen, die eine ölige Material auf der Hautoberfläche absondern. Die Talgproduktion ist Teil des angeborenen Immunsystems, die Schutz gegen pathogene Mikroben ist. Abnormal Talgproduktion und chemische Zusammensetzung sind auch eine klinische Symptom der spezifischen Hauterkrankungen. Talg enthält eine komplexe Mischung von Lipiden, einschließlich Triacylglyceride, die Spezies-spezifisch ist. Die breiten chemischen Eigenschaften von verschiedenen Lipidklassen ausgestellt behindern die spezifische Bestimmung von Talg Zusammensetzung. Analytische Techniken für Lipide erfordern in der Regel chemische Derivatisierungen, die arbeitsintensiv und Erhöhung Probenvorbereitungskosten. Dieses Papier beschreibt, wie Lipide, die aus Säugetier Hülle, separate breite Lipidklassen extrahieren durch Dünnschicht-Chromatographie und Profil der Triacylglycerid Inhalte mit Matrix-unterstützte Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie. Diese robuste Methode ermöglicht eine direkte Bestimmungder Triacylglycerid Profile zwischen den Arten und Personen, und sie kann leicht in jeder taxonomischen Gruppe von Säugetieren angewendet werden.

Introduction

Säugetier Integumentary Gewebe umfassen die Epidermis, Keratin-Strukturen (z. B. Haare und Nägel) und exokrinen Drüsen. Sebaceous-Typ exokrinen Drüsen mit Haarfollikel, die kollektiv als die Haarfollikel 1 genannten verbunden. Talgdrüsen frei eine ölige Exsudat auf die Hautoberfläche als Talg bezeichnet. Sebum ist weitgehend aus Glycerolipide (zB Triacylglyceriden [Tags]), freie Fettsäuren Acyle (FFS), Sterin / Wachsester und Squalen. Sebum der chemischen Zusammensetzung ist artspezifisch 2. Zusätzlich dazu, dass ein Teil des angeborenen Immunsystems und die Bereitstellung antimikrobieller Funktion 3, Talg-Lipide beeinflussen wichtige physiologische Prozesse, einschließlich Verdunstungswasserverlust durch die Haut 4, zelluläre Integrität und Genregulation 5, 6 und Medikamentenaufnahme. Sebaceous Lipidzusammensetzungen kann auch als Krankheitsmarker dienen. Veränderte Verhältnisse und Mengen von Talg-bStraßenlipidklassen sind klinische Anzeichen von Erkrankungen wie Akne vulgaris 7, 8 Schuppen, seborrhoische Dermatitis 8, 9 asteatosis unter anderem 10. Epidermal-und Haargewebe sind die variable Profile Sterin-und Derivate, TAGs, FFS, Ceramide, Phospholipide und andere kleinere Lipidkomponenten enthält. Da Integumentary Lipide können in Krankheitsprozesse funktionieren, Bestimmung von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzungen der TAGs zwischen gesunden und kranken Personen können nützlich für die klinische Diagnose der Krankheit sein.

Lipide werden im Allgemeinen als wasserunlösliche organische Verbindungen mit entweder polare oder unpolare, polare Substituenten 11 definiert. Lipid-Strukturen können lange Kohlenwasserstoffketten, sauerstoff Alkane (einschließlich Wachsester, FFAs, Alkohole, Ketone und Aldehyde), oder komplexe Ringstrukturen wie Cholesterin 12 sein. Es gibt acht Hauptklassen von Lipiden auf Basis von Struktur (FFS, glycerolipids [GL], Glycerophospholipiden [GP], Sphingolipide [SP], Sterin Lipide [ST], Prenols Lipide [PR], saccharolipids [SL] und Polyketide [PK]), die je nach der eine breite Palette von chemischen Eigenschaften aufweisen Klasse 13. Aufgrund der großen Unterschiede in den chemischen Eigenschaften der Lipidklassen wird eine direkte Profilierung ohne vorherige Derivatisierung der Lipid-Moleküle erwünscht. Eine emergente Verfahren in Lipidforschung ist Dünnschicht-Chromatographie (DC) in Kombination mit Matrix-unterstützte Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) 14.

MALDI-TOF-MS ist ausführlich in der Proteomik-Forschung verwendet werden, um Proteine ​​zu identifizieren, und ordnen sie in spezifischen Aminosäuresequenzen aufgrund der sehr genauen Peptidionenmasse "Fingerabdrücke" von Trypsin verdauten Proteine ​​15 erzeugt. MALDI-TOF-MS kann auch verwendet werden, um andere Biomolekül Klassen, einschließlich Lipide, wie TAGs 16-18 Profil. MALDI erfordert die Verwendung einer Matrix, typ.tisch eine organische Verbindung, die aromatische und konjugierte Doppelbindung Strukturen enthält. Die Matrix-Moleküle dienen, um sanft übertragen die Energie des Lasers auf der Analyten, die Förderung der Protonentransfer und produzieren einfach geladene Ionen in der Gasphase 19-21. Ionen werden mit einer Hochspannungsfeld unter Hochvakuum und beschleunigt in einem TOF-Massenanalysator, wo Ionen werden anschließend durch Unterschiede in der Geschwindigkeit, die proportional zu ihrer Masse-zu-Ladung-Verhältnisse getrennt. Selbst sehr große Biomoleküle können mit wenig Fragmentierung ionisiert werden, produziert einfach geladenen Molekülionenarten, für Spektrum-Analyse vereinfacht. Die Fähigkeit, Lipid-Moleküle direkt zu analysieren, ohne vorherige Derivatisierung ist bereit Annahme der MALDI-TOF-MS in der Lipid Forschungs 18 gefördert.

Dieser Beitrag stellt eine Routine-Methode, um aus den Haaren zu isolieren und zu analysieren Integumentary Lipide, Talgabsonderungen und plagiopatagium der östlichen rote Fledermaus (Lasiurus Borealis). Diese wird verwendet, um interspezifische Unterschiede in Fledermaus Integumentary Lipiden zu bestimmen, um den Krankheitsverlauf von White-Nose-Syndrom (WNS) 22 aufzuklären. WNS ist eine Pilzerkrankung von Fledermäusen und wird von den neu beschriebenen Arten psychrophilen Geomyces destructans 23-25 ​​verursacht. WNS hat den Tod von über 5 Millionen nordamerikanischen Höhle Fledermäuse verursacht und droht das Aussterben gefährdeter Fledermausarten, mit potenziellen wirtschaftlichen Auswirkungen der Milliarden von Dollar in Schäden an der Landwirtschaft 26,27. Um die Schritte in G. untersuchen destructans Infektion wurden die Lipide aus den Haar-und Flügelgewebe Osten rot Fledermäuse extrahiert und durch TLC in breite Lipidklassen getrennt, um die TAG-Fraktion für die anschließende Analyse durch MALDI-TOF-MS zu isolieren. TAGs enthalten kurze Acyl-Ketten und werden leicht durch MALDI-TOF-MS mit wenig Matrix Störungen festgestellt.

Protocol

ACHTUNG: Sie erhalten im Voraus alle erforderlichen behördlichen Genehmigungen für die Handhabung, den Transport, die Speicherung und Fledermäuse. Zulassungen muss auch von Ihrem institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss sowie vom Ausschuss institutionellen Biosicherheit gewonnen werden. Wenn Live-Fledermäuse (oder Gewebe des Nervensystems) zu behandeln sind, sollten Tierhalter für Tollwut geimpft werden. Fledermäuse in der aktuellen Studie verwendet wurden, von der Ozark St. Francis National Forest, AR, im Sommer 2010 nach Standardverfahren (Arkansas State University Institutional Biosafety Committee Genehmigung # 135349-1) 28 gesammelt. 1. Tissue Behandlung und Lipidextraktion Reinigen Sie alle Instrumente mit Methanol vor und zwischen Gewebe Sammlung von verschiedenen Individuen. Trim Haar (ca. 1,0 g) aus der Haut mit einer Schere und in einen 125 ml-Erlenmeyerkolben. Beispiel Talg aus Flügeloberfläche durch Waschen der Haut mit 4 – 6 Wattebällchen mit Chloroform benetzten: Methanol Lösungsmittel (C: M; 3.02 v / v), und diese in einem separaten Kolben. Extrahieren Gewebe mit 10 ml C: M (2:1 v / v) mit 0,5% butyliertem Hydroxytoluol (BHT), um eine Oxidation zu verhindern 29. Verwenden Sie nur hochwertige HPLC Lösungsmittel. Nach 2 Stunden, fügen etwa 0,5 g wasserfreies Sulfat in jeden Kolben, kurz mischen, und sammeln Sie die Lösungsmittel durch Filtration durch Filterpapier. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3 zweimal. Einmal mit 1:1 C: M und nacheinander mit 1.02 C: M. Pool Filtrate zusammen. Man dampft die vereinigten Filtrate wurden unter einem Strom von N 2, zu bestimmen, Trockengewicht und der Lipidrest 3:2 C auflösen: M (mit 0,5% BHT) in einer Konzentration von 10 mg / ml. Bewahren Sie die Probe in Glasfläschchen bei -20 ° C Es ist im Allgemeinen am besten, um Proben innerhalb eines Monats nach der Probenahme analysieren und Frost-Tau-Zyklen zu minimieren. 2. Lipid Trennung durch präparative Dünnschicht-Chromatographie Bereiten Sie im Voraus Lösungsmittel gewaschen 1,5 ml microcentrifuge Rohre durch Füllen 3:2 C: M, Spülen mit Aceton und Lufttrocknung. Dies geschieht, um Weichmacher, die mit später Massenspektrometrie-Analyse stören können. Bewahren Probenröhrchen in einer staubfreien Behälter und Handhabung dieser Rohre nur mit Handschuhen eine Kontamination durch Hautöle zu verhindern. Aktivieren Sie die DC-Platte durch erste Pre-Entwicklung mit C 03.02: M. Fügen Sie genug Lösungsmittel auf die DC-Kammer bis zu einer Tiefe von 1 cm, dann legen Platte in der Kammer (in der Nähe mit Glasdeckel) und damit das Lösungsmittel vollständig auf die Oberseite der Platte laufen. Dies dauert etwa 45 min. Entfernen Sie die Platte und trocken in einem Abzug bis das Lösungsmittel verdampft (ca. 15 min), dann in einem Ofen für mindestens 10 min bei 120 ° C Legen Sie ein Bleistiftstrich auf der Oberseite der Platte, um die Orientierung zu halten, wenn Proben angewendet werden. Legen Sie eine gerade Bleistiftlinie, 1,5 cm von der Unterkante der Platte, um die Grundlinie, wo die Probe und Standards gesetzt werden zu markieren. Bereiten DC-Kammer, indem einStück Filterpapier groß genug, um die beiden kurzen Wände säumen und eine lange Wand. Das Filter-Liner in die Kammer. Es wird vollständig zu benetzen, wenn Lösungsmittel zu der Kammer zugegeben. Es werden 100 ml der mobilen Phase Lösungsmittel, das Hexan: Diethylether: Essigsäure (H: E: A, 80:20:2 v / v / v). Gießen Lösungsmittel in die Kammer, um eine Tiefe von etwa 1 cm zu ergeben. Deckel mit dem Glasdeckel mit einem Silikonfett Dichtung am oberen Rand der Kammer. Lassen Sie die Kammer über Nacht vor dem Einsatz ins Gleichgewicht. Manuell gelten die Probe auf die hergestellte Platte mit einer Kapillare oder einer Pipette als ein kontinuierlicher Streifen von etwa 1,5 cm von einem Rand bis 1,5 cm auf die andere Kante. Eine automatisierte Proben Applikator wird bevorzugt, da sie die Probe in einem homogenen Streifen mehr zu laden. Verwenden Sie die äußeren Spuren des DC-Platte auf etwa 20 ul Mischung aus Sterin, FFS, Tags und Sterolesters Normen vor Ort (Einsatz bei 10 mg / ml; vorgefertigten Mischungen erhalten werden kann). Legen Sie die DC-Platte geladen indie Kammer ins Gleichgewicht gebracht, in der Nähe mit dem Deckel, und die Entwicklung der Platte, bis das Lösungsmittel läuft an der oberen Kante. Dies dauert etwa 45 Minuten mit dem hier beschriebenen mobilen Phase. Entfernen Sie die Platte aus der Kammer und damit der überschüssige Lösungsmittel aus der Platte in einem Abzug für ca. 1 min verdampfen. Spray mit 0,05% Rhodamin 6G in 95% Ethanol. Visualisieren Lipid-Bands im Rahmen eines langwellige UV-Lampe. Filter mit einem Bleistift die R f-Position für die Fluoreszenzbanden in der Probe und Standards gelöst. Eine fotografische Aufzeichnung kann an dieser Stelle berücksichtigt werden. Identifizieren Sie die entsprechende Bande mit dem TAG-Standard und entfernen Sie sie von der Platte durch Abschaben der Kieselsäure mit einem Spatel auf ein großes Stück Papier wiegen Glassine. Übertragen Siliciumdioxid in ein 1,5 ml Lösungsmittel gewaschenen Mikrozentrifugenröhrchen. 1,0 ml 03.02 C: M Lösungsmittel, um das Probenröhrchen, beschallen für 1 min pelletieren der Kieselsäure durch Zentrifugieren, und übertragen das Lösungsmittel in einem neuen vorgewogen Röhre. Wiederholen thE vorherigen Schritt bündeln die Filtrate und dampft das Lösungsmittel unter einem Strom von N 2. Das getrocknete Rückstand enthält TAGs unter N2 im Dunkeln bei 4 ° C während zusätzliche Gewebeproben werden durch TLC getrennt. Rhodamin 6G in Proben vorhanden, aber es ist unlöslich in Hexan und während der Proben Auflösung unmittelbar vor der MS-Analyse entfernt. 3. TAG Analyse durch MALDI-TOF-MS Eine frische α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA) Matrixlösung durch Lösen von 10 mg in 1 ml CHCA Lösungsmittel (49,5% Ethanol, 49,5% Acetonitril und 1% iger wässriger 0,1% TFA). Bereiten adrenocarticotropic Hormon (ACTH; 18-39 Clip, 2465,1989 Da) für Instrumenten Auflösung und Empfindlichkeit Prüfung durch Mischen von 1 ul von ACTH (1 mg / ml) mit 39,5 ul 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), um eine 10 pmol / ul erhalten Stammlösung. Dies kann bei -20 ° C zur weiteren Verwendung gelagert werden. Bereiten Sie eine frische Arbeits ACTH SOLUTIon (1 pmol / ul), indem 1 ul der 10 pmol / &mgr; l Stammlösung, Mischung mit 9 ul 0,1% TFA, und dann Mischen (1:1) mit 10 ul des CHCA Matrixlösung in einen 500 fmol erhalten / ul-Konzentration. Bereiten TAG Standards bei 10 mg / ml in 3.02 C: M für die MALDI-Gerätekalibrierung (z. B. Tricaprin [470,361 Da], Tricaprylin [554,455 Da], Trilaurin [638,549 Da], Tripalmitin [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , Trimyristin [806,736 Da], Triolein [884,783 Da], Tri-11-eicosenoin [968,877 Da] und Trierucin [1052,971 Da]). Bereiten Triolein bei 10 mg / ml in 3.02 C: M für einen externen Lock-Massenkalibrierung TAG Standard. Man löst die gespeicherten TAG Proben in Hexan zu einer 10 mg / ml Lösung. Bereiten Sie eine 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) stock Lösung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) mit 90% Methanol für die Verwendung als Probe und Standard-Matrix. Auch bereiten eine 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) Lösung von NaOH. Decken Sie die Röhrchen mit DHB-Lösung unter Verwendung von Aluminium foi l den Inhalt vor Licht zu schützen. Mix (in Pre-Washed-Rohre) 10,0 ul DHB-Matrix, 10.0 ul Probe oder Standard und 5,0 ul 1,0 M NaOH. Mischen und kurz zentrifugieren, um das Rohr Mischung auf den Boden zu bringen. 1.0 Spot-ul-Standard, Probe oder ACTH auf einem MALDI-Edelstahl-Zielplatte und in einem Exsikkator bis trocken. Legen Sie die Zielplatte in das Gerät für die Datenerfassung. Führen MALDI-TOF-MS-Analysen in positive Reflektronmodus. Tune und kalibrieren Sie das Gerät wie vom Hersteller des Instruments mit der ACTH-und TAG-Standardlösungen beschrieben. Erwerben Spektren für jede Probe auf der Zielplatte entdeckt (in Übereinstimmung mit Gerätespezifikationen; Parameter für diese Arbeit waren 5 Hz-Laserfeuerrate, ~ 100 Aufnahmen pro Spot, um eine durchschnittliche Spektrum zu erhalten). Nach dem Glätten und Subtraktion der Hintergrund von MALDI-Spektren, Prozess-Ionen-Peaks manuell mit den Online-Suchmaschine LIPID MAPS (/ Tools / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). Kopieren Sie die Liste Spektren in die Liste der Vorläufer-Ionen und Intensität ein. Begrenzen Sie die Suche auf gewünschte Acyl-Komposition. Identifizieren TAGs von der Masse / Ladung (m / z)-Verhältnisse von Ionen im Spektrum für jede Probe vorhanden ist. Wenn Fettsäuremethylester (FAME) Prozentsätze sind von separaten GC / MS-Analyse, fügen Sie diese Daten, um Wahrscheinlichkeiten TAGs vorhanden zu erhalten. INSTRUMENT: Massenspektrometer in dieser Studie verwendet wird, ein Waters MALDI Micro MX (mit einem 337 nm 20 Hz N 2-Laser ausgestattet ist). Jede Hersteller MALDI-Instrument mit positiven Reflektronmodus Fähigkeit verwendet werden. Allgemeine Einstellungen verwendet werden, sind Impulsspannung 2000 V; Reflectron, 5.200 V, Quelle, 15.000 V, mit Datenerfassung mit MassLynx-Software (Version 4.0). Diese Betriebsbedingungen bieten Massenauflösung von mehr als 12.000.

Representative Results

Das Extraktionsverfahren zur Isolierung von Gesamt-Lipide aus durch Folch 30 beschriebenen Gewebe ist ein einfaches Verfahren, die hier angepasst ist. Nach der Gewebeentnahme und Lösungsmittelverdampfung, erscheinen die Lipide häufig als gelblicher Film. Die gelbe Farbe ist sehr wahrscheinlich von Proteinverunreinigungen, die durch Durchführung einer Flüssig-Flüssig-Extraktion entfernt werden können. Diese zusätzliche Probenverarbeitung ist in diesem Verfahren nicht notwendig, da präparative TLC trennt die TAG-Fraktion von solchen Verunreinigungen. Die Zugabe von frischem wasserfreiem Natriumsulfat auf allen Filterstufen hilft bei der Reduzierung Wasserverschmutzung, die genaue Lipidgewichtsbestimmungen betrifft. Säugetier Integumentary Lipidanalysen durch präparative DC mit H: E: A als mobile Phase wird in der Regel beheben vier verschiedene Banden, die (ausgehend vom Ursprung) Sterole, FFS, Tags und Sterinester / Wachsester / Squalen (Abbildung 1). Gelegentlich, wenn Sie analytischecal hohe Leistung (HP) TLC mit dem H: E: Eine mobile Phase, die Sterin-Ester, Wachsester und Squalen werden sich trennen und als drei getrennte Streifen erscheinen. Unter den in der vorliegenden Studie verwendeten Bedingungen werden die Sterol / wachsartige Ester nicht getrennt. Wenn diese Banden von Interesse sind, kann die mobile Phase Isooctan schaltet werden: Diethylether (95:5 v / v), und die HPTLC-Platte kann durch Scanning-Densitometrie analysiert. Andere Faktoren können schlechte Trennung führen. Diese werden in der Regel, indem das Filterpapier in der Kammer, Auftragen von Schmierfett für eine Abdichtung auf dem Deckel, Äquilibrierung der Kammer über Nacht, und sauber zu halten TLC Kammern, gleichbleibende Qualität TLC Trennungen und Daten zu erhalten, eliminiert. Vertreter für TAGs aus dem östlichen roten Fledermaus isoliert erhaltenen MALDI-TOF-Massenspektren sind in den Abbildungen 2 und 3 dargestellt. Diese Spektren enthalten TAG Ionen-Peaks im Massenbereich zwischen m / z 850-910, die typisch für TAGs aus Nicht-Wassersäugetier isoliert ists. Die Zugabe von 1,0 M NaOH fördert einzeln Na +-Ionen, die stabiler als H +-Ionen aufgeladen. Zusätzlich zur Stabilität, das Fehlen von H + und K +-Ionen erhöht einfache Spektralanalyse. Die m / z 850-910 Ionen-Peaks entsprechen 16.00, 18.00, 18.01, 18.02 und FA-Einheiten als die dominierenden Bestandteile in Acyl-TAGs (Tabelle 1). Möglich FA Einheiten der TAGs kann zunächst durch insgesamt vorhandenen Ionen m / z in der MALDI-TOF-MS-Spektren und die Unterschiede zwischen den Arten und Individuen abgeleitet bestimmt werden. Wenn jedoch die spezifische Verhältnisse von Säuregehalt benötigt werden, wird MS / MS oder Gaschromatographie (GC / MS) verwendet werden. Weitere Angaben zu den Acyl-Verhältnisse können durch Beobachtung der Spitzen in der Diacylglyceride Bereich des Spektrums (4) abgeleitet werden. Diacylglyceride von TAG Fragmentierung in der MALDI-Quelle hergestellt und kann in der m / z 590 gefunden werden – 650 Region. TAG Fragmentierung kann erhöht werden durchWeglassen der Zugabe von 1,0 M NaOH 16. Eastern roten Fledermausflügel Gewebe wird von einem dominanten Peak bei m / z 879,7 und Haargewebe mit einer dominanten Peak bei m / z 881,8 (Abbildung 2 und 3) aus. Peaks bei m / z 907,8, 879,7 und 855,7 (POP, PPOs) etwa auch in der Intensität (~ 50%) in der Haargewebe mit dem Peak bei 853,7 Befinden ~ 40%. Zusammensetzung Elemental Composition Beobachteten Massen Na + TAGs Na + TAGs SSO C 57 H 108 O 6 911,8 OOS, LSS C 57 H 106 O 6 909,8 OOO, NSS, LSO C 57 H104 O 6 907,8 LOO, LLS C 57 H 102 O 6 905,8 LLO, OOLn C 57 H 100 O 6 903,7 LLL C 57 H 98 O 6 901,7 LLLN C 57 H 96 O 6 899,7 LLnLn C 57 H 94 O 6 897,7 Lnlnln C 57 H 92 O 6 895,7 OSP C 55 H 104 O 6 883,8 LSP, OOP, Sopo C 55 H 102 O 6 881,8 LOP, LNSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ Td> 879,7 LLP, LNOP, Lopo C 55 H 98 O 6 877,7 LNLP, LLPO, LnOPo C 55 H 96 O 6 875,7 LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873,7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7 PPS C 53 H 102 O 6 857,8 POP, PPOS C 53 H 100 O 6 855,7 OOM, PPL, Popos, Popo C 53 H 98 O 6 853,7 PPLN, PPOL, Popoo, Myoo C 53 H 96 O 6 851,7 LLM, Lnom C 53 H 94 </sub> O 6 849,7 PPP, Ssla C 51 H 98 O 6 829,7 PPPO, Osla C 51 H 96 O 6 827,7 PPoPo, pMyo C 51 H 94 O 6 825,7 LnLnLa C 51 H 86 O 6 817,6 MMS, Slap, PPM C 49 H 94 O 6 801,7 SLaPo, PPOM, PPMy C 49 H 92 O 6 799,7 PoPoM, OOCa C 49 H 90 O 6 797,7 MMP C 47 H 90 O 6 773,7 MMPo, OCAP C 47 H 88 O6 771,7 OCaPo C 47 H 86 O 6 769,6 MMM, PPCA, PMLA C 45 H 86 O 6 745,6 PoPCa, PoMLa C 45 H 84 O 6 743,6 Popoca C 45 H 82 O 6 741,6 LaLaP, MMLa, MCAP C 43 H 82 O 6 717,6 LaLaPo C 43 H 80 O 6 715,6 OO C 39 H 72 O 5 643,5 OL C 39 H 70 O 5 641,5 LL C 39 H 68 O 5 639,5 SP C 37 H 72 O 5 619,5 OP C 37 H 70 O 5 617,5 LP C 37 H 68 O 5 615,5 Tabelle 1. Die Fettsäurezusammensetzung, elementare Zusammensetzung und Isotopenmasse sodiated Addukte von Triacylglyceriden und Diacylglyceride. Ln = Linolensäure (18.03), L = Linolsäure (18.02 Uhr), O = Ölsäure (18.01), S = Stearinsäure (18.00), P = Palmitinsäure (16.00), Po = Palmitoleinsäure (16.01), M = Myristinsäure (14.00 Uhr), My = Myristoleinsäure (14.01) La = Laurin Säure (0.00), Ca = Caprinsäure (10.00). Fig. 1 ist. Dünnschichtchromatogramm der breiten Lipidklasse Trennung von Hexan: Diethylether: Essigsäure(80:20:2 v / v / v) als mobile Phase. Die Band zwischen Sterin-und FFA wurde nicht von einem Standard identifiziert, sondern kann eine Fettalkohol-oder Wachsters sein. 2. Expanded TAG Region MALDI-TOF-Massenspektrum von sodiated TAGs. (M / z 700-950) aus dem östlichen rote Fledermaus (L. borealis) Flügelgewebe Peaks bei m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) und m identifiziert / z 879,7 (LOP, LNSP, LSPo). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 3. Expanded TAG Region MALDI-TOF-Massenspektrum von sodiated TAGs (m / z 700-950) aus dem östlichen rote Fledermaus (L. borealis) Haargewebe.Peaks bei m / z 905,8 (LOO, LLS) und m / z 907,8 (OOO, NSS, LSO) identifiziert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . 4. DAG Region von MALDI-TOF-Massenspektrum von sodiated DAG-Fragmente (m / z 530-730). Aus Ost-rote Fledermaus (L. borealis) Flügelgewebe Peaks bei m / z 643,5 (OO) und m / z 615,5 (LP) identifiziert . Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

Dieser Beitrag stellt eine einfache und robuste Methode zur Trennung breiten Lipidklassen aus Säugetier-Hülle isoliert durch präparative DC und Bestimmung TAG Profile durch MALDI-TOF-MS, ohne zeitaufwendige Derivatisierung der Lipid-Moleküle. Die kritischen Schritte in der Herstellung von Qualitäts Spektren von TAGs mit MALDI-TOF-MS sind: 1) Die erfolgreiche Extraktion der Verbindung mit minimaler Verunreinigung oder Oxidation, 2) eine ausreichende Trennung und Isolierung durch Chromatographie und 3) Hohe Auflösung und Massengenauigkeit durch MALDI-TOF MS.

Dieses Papier zeigt die Methode durch Extraktion und Trennung der neutralen Lipidfraktion aus der plagiopatagium der östlichen rote Fledermaus TAG MS-Profile zu erhalten. Während die vorliegende Studie verwendet ein Fledermausarten (Mammalia: Chiroptera) können diese Verfahren erweitert, um Lipide der Hautanhangsgebilde jeglicher Säugerspezies zu untersuchen. Bat Hülle ist, indem sie vorwiegend Cholesterin, mit geringeren Mengen von TAGs, FFS, squa gekennzeichnetlene und Sterol / Wachsester. Sebum Lipid-Verhältnisse in Fledermäuse unterscheiden sich von den Menschen in diesem Squalen in geringen Mengen vorhanden ist (im Gegensatz zu bis zu 16% beim Menschen), während Cholesterin in größere Verhältnisse eintritt (1-7% im Menschen, sondern von 26 bis 62% in Fledermäuse) 22 , 31. Menschenhaare enthalten etwa 3% TAGs, während Verhältnisse bis zu 28% sind in Ost-rote Fledermaus Haar gefunden. Die Extraktion der Lipidproben von Fledermäusen ist ähnlich wie bei anderen Arten. Während in dieser Studie Watte in Lösungsmittel eingeweicht werden verwendet, um Sebum zu entfernen, kann man auch eine Ampulle oder Probenröhrchen, das Lösungsmittel zu invertieren auf der Oberfläche der Hülle mehrere Male. Specialized Tape-Produkte bieten auch alternative Mittel zur Oberflächenlipide extrahieren 32. Ein wichtiger Teil eines richtigen Lipidextraktion ist eine Kontamination durch Hautöle zu minimieren. Dies ist leicht durch mit Methanol halten ein Squeeze-Flasche und Spritz alle Glaswaren und Geschirr, Wischutensilien mit einem Gewebe zwischen allen Proben-und Untersuchungshandschuhe tragen erreicht. Oxidation of fach ungesättigten Acylgruppen durch Zusatz von BHT verhindert, und es sollte unabhängig von der Temperatur Proben bei gespeichert werden.

Biomolekül-Analyse erfordert in der Regel eine chromatographische Schritt zur getrennten Molekülen von Interesse von Schadstoffen. TLC wird in diesem Verfahren, das Instrumentierungs Anforderungen für Gas-oder Flüssigkeitschromatographie vermeidet und erfordert weniger technische Erfahrung, robuste und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Abhängig von der Lipidklasse von Interesse ist, können viele verschiedene mobile Phasen eingebaut werden. Weiterhin kann die Verwendung von HPTLC-Platten und Scanning-Densitometrie verwendet, um quantitative Ergebnisse zu erzielen. Während die Varianten der TLC Methoden sind zu zahlreich, um sie hier einige gemeinsame mobile Phasen in Lipid TLC verwendet werden, schließen Chloroform: Methanol: Wasser zur Abtrennung von Phospholipiden und Glycolipiden oder Isooctan: Ethylether zur Trennung von nicht-polaren Lipiden 28. In Bezug auf die Trennung von anderen TAGs Lipidklassen, H: E: A solvent System arbeitet konsequent und liefert vergleichbare Ergebnisse.

Ein weiterer Vorteil für die Verwendung von DC ist, dass Bänder von Interesse kann schnell unter Verwendung von MALDI-TOF-MS ohne vorherige Derivatisierung der Analyten profiliert werden. In dieser Studie wird die Kieselsäure aus der TLC-Platte entfernt, und der Analyt wird von der sie durch Ultraschallbehandlung in einem Lösungsmittel und anschließende Zentrifugation, um das Adsorptionsmittel und das Verdampfen des eluierenden Lösungsmittel abzutrennen eluiert. Alternativ kann Matrix direkt auf Analyten Bänder getrennt auf DC-Platten und dann direkt durch MALDI-TOF MS analysiert, 33 aufgebracht werden. Erfolgreiche Profilierung durch MALDI-TOF-MS ist auf ausreichende Probenvorbereitung und Kompetenz des Betreibers mit Tuning und Kalibrierung des Instruments verlassen. Das Instrument sollte täglich mit Standards für die Molekulargewichtsbereich angemessen für die Moleküle von Interesse kalibriert werden. Die geeignete Empfindlichkeit und Auflösung (zB ≥ 10.000) der Geräte sollte auch confirme werdentäglich mit ACTH-d.

Die Talgdrüsen Lipidbestand auf der Oberfläche von Säugetier Hülle gefunden, kann eine Rolle spielen bei der Kolonisation durch Bakterien / Pilzerreger. Daher Kenntnis der chemischen Zusammensetzung zwischen den Arten und Einzelpersonen können Anhaltspunkte über Prozesse der Menschen-und Tierkrankheiten. Intraspezifische Unterschiede zwischen kranken und gesunden Personen können klinische Zeichen darstellen, die Hilfe bei Krankheit und Diagnose. Außerdem, wenn bestimmte Verbindungen, die das mikrobielle Wachstum hemmen vorhanden sind, können diese für die Verwendung in der Behandlung von Krankheiten und Prävention identifiziert werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützung wurde von Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony James Lamark, Amy Fischer, Hannah Blair und Cheyenne Gerdes während der Entwicklung von Labormethoden zur Verfügung gestellt. Wir möchten die Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) danken für die Unterstützung bei TLC Abtastdensitometrie. Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0701890) in der Arkansas Biosciences Institute: MALDI-TOF-MS für dieses Projekt verwendet wurde, durch die NSF EPSCoR, RII Verfügung gestellt. Die Finanzierung wurde von einem US-Fischerei und Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, der Nationalen Gesellschaft für Höhlenforschung und das Zentrum für Nordamerika-Forschung und Bat Conservation an der Indiana State University zur Verfügung gestellt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image