JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

פרופיל תוכן Triacylglyceride בשומני הכסות בת על ידי כרומטוגרפיה Preparative שכבה דקה וMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

integument יונקים מכיל שומני ממס לחילוץ שיכול לספק אופייני הרכב כימי של מינים בודדים. מאמר זה מציג שיטה שגרתית להפרדת כיתות שומנים רחבות בודדו מרקמות הכסות באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה וקביעת פרופיל triacylglyceride ידי ספקטרומטריית בסיוע מטריקס לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה המונית.

Abstract

Integument היונקים כולל בלוטות החלב שמפרישות חומר שמנוני על פני העור. ייצור החלב הוא חלק ממערכת החיסון המולדת, כי הוא מגן מפני חיידקים פתוגניים. ייצור החלב נורמלי והרכב כימי הם גם סימפטום קליני של מחלות עור מסוימות. החלב מכיל תערובת מורכבת של שומנים, כולל triacylglycerides, אשר הוא מינים ספציפיים. התכונות כימיות רחבות הוצגו על ידי שיעורי שומנים מגוונים לעכב את הקביעה הספציפית של הרכב חלב. שיטות אנליטיות לשומנים בדרך כלל דורשות derivatizations כימי שהם עתירי עבודה ועלויות הכנת מדגם עלייה. מאמר זה מתאר כיצד לחלץ שומנים מintegument יונקים, כיתות שומנים רחבות נפרדות על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה, ופרופיל תוכן triacylglyceride באמצעות ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסת desorption הלייזר בסיוע מטריקס / יינון. שיטה חזקה זו מאפשרת קביעה ישירהשל פרופילי triacylglyceride בין מינים וליחידים, וזה יכול להיות מיושם בקלות לכל קבוצה הטקסונומי של יונקים.

Introduction

רקמות הכסות של יונקים כוללות את האפידרמיס, מבני keratinous (למשל שיער וציפורניים), ובלוטות אקסוקרינית. בלוטות אקסוקרינית החלב מסוג המשויכות זקיקי שיער, אשר יכונו יחידת pilosebaceous 1. בלוטות החלב לשחרר exudate שומני על פני העור המכונה חלב. החלב מורכב ברובו מglycerolipids ([תגיות] למשל triacylglycerides), acyls שומן חופשי (חומצות שומן חופשיות), אסטרים סטרולים / שעווה, וסקוואלין. ההרכב הכימי של החלב הוא מינים ספציפיים 2. בנוסף להיותו חלק ממערכת החיסון המולדת ומתן פונקציה מיקרוביאלית 3, שומני החלב משפיעים על תהליכים פיסיולוגיים חשובים, כולל ירידה באידוי מים דרך עור 4, יושרת הסלולר ורגולציה של גני 5, וספיגת תרופת 6. קומפוזיציות שומנים החלב יכולות גם לשמש כסמני מחלה. יחסים וכמויות של החלב ב Alteredכיתות שומנים כביש הן סימנים קליניים של מחלות כגון אקנה דלקתי 7, 8 קשקשים, seborrheic dermatitis 8, asteatosis 9, בין יתר 10. רקמות באפידרמיס ושיער כוללות פרופילים משתנים המכילים סטרולים ונגזרים, תגיות, חומצות שומן חופשיות, סרמידים, פוספוליפידים ומרכיבי שומנים קטין אחרים. בגלל שומני הכסות יכולים לתפקד בתהליכי מחלה, קביעת הבדלים בהרכב כימי של תגים בין אנשים בריאים וחולים עשויה להיות שימושית לאבחון קליני של מחלה.

שומנים בדרך כלל מוגדרים כתרכובות אורגניות לא מסיסים במים עם מתמירים או פולריים או פולריים קוטביים 11. מבני שומנים בדם עשויים להיות שרשרות ארוכות פחמימנים, אלקאנים מחומצן (כולל אסטרים שעווה, חומצות שומן חופשיות, כהלים, קטונים ואלדהידים), או מבני טבעת מורכבים כגון כולסטרול 12. ישנם שמונה סוגים עיקריים של שומנים המבוססים על מבנה (חומצות שומן חופשיות, glycerolipids [GL], glycerophospholipids, sphingolipids [SP], שומנים [GP] סטרולים [ST], שומני prenol [יח"צ], saccharolipids [SL], וpolyketides [PK]), אשר תערוכת מגוון רחב של תכונות כימיות בהתאם כיתה 13. בשל השונות הגדולות בתכונות כימיות של כיתות שומנים בדם, פרופיל ישיר ללא derivatization המוקדם של מולקולות שומנים הוא רצוי. שיטה מתהווה אחד במחקר שומנים היא כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) בשילוב עם ספקטרומטריית הלייזר desorption בסיוע מטריקס / יינון הזמן של בריחה ההמונית (MALDI-TOF MS) 14.

MALDI-TOF MS נעשה שימוש נרחב במחקר proteomic לזהות חלבונים ולקשר אותם לרצפי חומצות אמינו ספציפיים בשל המסה "טביעות אצבעות" מאוד מדויקות יון פפטיד שנוצרו מחלבונים מתעכל טריפסין 15. גם MALDI-TOF MS יכול לשמש לפרופיל כיתות biomolecule אחרים, כוללים שומנים כגון תגיות 16-18. MALDI דורש שימוש במטריצה, typically תרכובת אורגנית המכילה מבני קשר כפול ארומטיים ומצומדות. מולקולות המטריצה ​​לשרת להעביר בעדינות את האנרגיה של הלייזר לanalytes, לקדם העברת פרוטון, ולייצר טעונים ביחידים יוני גז שלב 19-21. יונים חשופים לשדה מתח גבוה תחת ואקום גבוה ומואץ למנתח המוני TOF שבו יונים מופרדים לאחר מכן על ידי הבדלים במהירויות שאינם פרופורציונליים ליחסי מסה לתשלום שלהם. יכולה להיות מיונן אפילו ביומולקולות גדולה מאוד עם פיצול קטן, בהפקת טעונה ביחידים מיני יון מולקולריים לניתוח ספקטרום פשוטים. היכולת לנתח מולקולות שומנים ישירות ללא derivatization לפני קידמה אימוץ מוכן של MALDI-TOF MS במחקר lipidomic 18.

מאמר זה מציג שיטה שגרתית לבודד ולנתח שומני הכסות מהשיער, הפרשות וplagiopatagium של המחבט האדום במזרח החלב (Lasiurus borealiים). זה משמש כדי לקבוע וריאציות interspecific בשומני הכסות מחבט על מנת להבהיר את תהליך המחלה של תסמונת White-Nose (WNS) 22. WNS הוא מחלה פטרייתית של עטלפים והיא נגרמת על ידי מיני psychrophilic תיארו החדש Geomyces destructans 23-25. WNS גרם למותם של מעל 5 מיליון עטלפים במערה בצפון אמריקה ומאיים על ההכחדה של מיני עטלפים פגיעים, עם השפעות כלכליות פוטנציאליות של מיליארדים דולרים בנזק לתעשייה החקלאית 26,27. כדי לחקור את השלבים בג destructans זיהום, שומנים הוצאו משיער ואגף הרקמות של עטלפים אדומים במזרח ומופרדים לכיתות שומנים רחבות על ידי TLC לבודד את החלק היחסי TAG לניתוח שלאחר מכן על ידי MALDI-TOF MS. תגיות להכיל רשתות acyl קצרות ומזוהות בקלות על ידי MALDI-TOF MS עם הפרעות מטריצה ​​קטנות.

Protocol

זהירות: השג מראש את כל האישורים הפדרלי הנדרשים לטיפול, הובלה, אחסון ועטלפים. חייבים להיות גם קיבלו אישורים מהוועדה שלך מוסדי טיפול בבעלי החיים ושימוש, כמו גם מועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית שלך. אם עטלפים חיים (או רקמת מערכת עצבים) הם להיות מטופלים, מטפל בבעלי החיים צריכים להיות מחוסן לכלבת. עטלפים השתמשו במחקר הנוכחי נאספו מיער Ozark פרנציסקוס הקדוש הלאומי, AR, במהלך הקיץ 2010 על פי שיטות סטנדרטיות (האישור # של אוניברסיטת מדינת ארקנסו ועדת בטיחות ביולוגית המוסדית 135,349-1) 28. 1. רקמות טיפול ויפידים הפקה יש לנקות את כל הכלים עם מתנול לפני ובין אוסף רקמות מאנשים שונים. לקצץ את שיער (כ 1.0 ז) מעור עם מספריים ומקום בבקבוק מיליליטר Erlenmeyer 125. החלב לדוגמא משטח כנף על ידי שפשוף עור עם 4 – 6 כדורי צמר גפן רטוב עם כלורופורם: ממס מתנול (C: M; 3:02 V / V), ולמקם את אלה בבקבוק נפרד. לחלץ רקמות עם 10 מיליליטר של C: M (2:1 V / V) מכיל 0.5% hydroxytoluene butylated (BHT) כדי למנוע התחמצנות 29. להשתמש בחומרים ממסים איכות HPLC בלבד. לאחר 2 שעות, להוסיף על 0.5 גרם סולפט נטול מים לכל בקבוק, לערבב לזמן קצר, ולאסוף הממס על ידי סינון דרך נייר סינון. חזור על שלבים 1.2 ו1.3 פעמיים. פעם אחת עם 01:01 C: M ורצף עם 01:02 C: מ ' בריכת filtrates יחד. להתאדות filtrates נקווה תחת זרם של N 2, לקבוע משקל יבש, ולפזר את שאריות שומנים ב3:02 C: M (עם 0.5% BHT) לריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר. מדגם חנות בצלוחיות זכוכית ב -20 ° C. זה בדרך כלל הטוב ביותר כדי לנתח דגימות תוך חודש ימים לאחר איסוף דגימה וכדי למזער להקפיא להפשיר מחזורים. 2. הפרדת שומנים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה Preparative הכן ב1.5 מיליליטר microce שטף הממס מראשצינורות ntrifuge על ידי מילוי עם 3:2 C: M, שטיפה עם אצטון, ואוויר ייבוש. זה נעשה כדי להסיר plasticizers שיכולה להפריע לניתוח ספקטרומטריית מסה מאוחר יותר. אחסן דוגמיות במכל ללא אבק ולטפל בצינורות אלה רק עם כפפות על מנת למנוע זיהום משמני עור. הפעל את צלחת TLC על ידי מראש פיתוח ראשון עם 3:2 C: מ ' הוסף מספיק ממס לתא TLC עד לעומק של 1 סנטימטר, ואז למקם את הצלחת בתא (הדוק עם מכסה זכוכית) ולאפשר הממס לרוץ לחלוטין לחלק העליון של הצלחת. זה לוקח בערך 45 דקות. הסר את הצלחת ויבשה במנדף עד מתאדה ממס (כ -15 דקות), ואז מכניס לתנור לדקות לפחות 10 ב120 ° C. מציב סימן עיפרון בחלק העליון של הצלחת כדי לשמור על אורינטציה כאשר דגימות מוחלות. הנח קו עיפרון ישר, 1.5 סנטימטר מהקצה התחתון של הצלחת, כדי לסמן את נקודת ההתחלה שבו לדוגמא והסטנדרטים תוצבנה. הכן את חדר TLC על ידי חיתוךפיסת נייר סינון גדול מספיק כדי מרפד שני קירות קצרים וקיר אחד ארוך. הנח את תוחם נייר הסינון לתוך התא. זה יהיה רטוב באופן מלא כאשר ממס נוסף לחדר. הכן של השלב הנייד הממס, שהוא הקסאן 100 מיליליטר: אתר diethyl: חומצה אצטית (H: E:; 80:20:2 V / V / V). יוצקים ממס לתוך התא כדי לתת עומק של כ -1 סנטימטר. מכסה עם מכסה הזכוכית, באמצעות חותם גריז סיליקון לאורך הקצה העליון של החדר. לאפשר החדר כדי לאזן בין לילה לפני השימוש. החל המדגם ידני לצלחת מוכנה עם צינור נימים או פיפטה כמו פס רציף מכ -1.5 סנטימטר מקצה אחד ל1.5 סנטימטר לקצה האחר. המוליך מדגם אוטומטי עדיף שכן הוא יהיה לטעון את המדגם בפס הומוגני יותר. השתמשו בנתיבים החיצוניים של צלחת TLC לזהות על 20 תערובת μl של סטרולים, חומצות שומן חופשיות, תגיות, וסטנדרטים אסתר סטרולים (שימוש ב10 מ"ג / מיליליטר; ניתן להשיג תערובות תערובת של עוגיות). מניחים את צלחת TLC הועמסהקאמרי equilibrated, הדוק עם המכסה, ולפתח את הצלחת עד הממס רץ לקצה העליון. זה לוקח בערך 45 דקות עם השלב הנייד שתואר כאן. הסר את הצלחת מהחדר ולאפשר הממס העודף להתאדות מהצלחת במנדף לדקות על 1. ספריי עם 0.05% 6G rhodamine ב95% אתנול. דמיינו להקות שומנים מתחת לפנס אולטרה סגול באורך גל ארוך. מארק בעיפרון את המיקום ו R עבור להקות הניאון נפתרו במדגם והתקנים. תיעוד מצולם ניתן לקחת בשלב זה. זהה את הלהקה מתכתבת עם סטנדרטי TAG ולהסיר אותו מהצלחת על ידי גירוד את סיליקה עם מרית על גבי פיסת נייר שקופה לשקול נייר גדולה. העבר סיליקה לצינור microcentrifuge שטף ממס 1.5 מיליליטר. הוספת 1.0 מיליליטר של 3:2 C: ממס M לצינור המדגם, sonicate דקות 1, גלולה סיליקה ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן להעביר את הממס לתוך צינור שקל מראש חדש. ה חזורדואר שלב קודם, בריכת filtrates, ולהתאדות הממס תחת זרם של N 2. אחסן את השאריות יבשות המכילות תגיות תחת N 2 בחושך ב 4 ° C ואילו דגימות רקמה נוספות מופרדות על ידי TLC. Rhodamine 6G קיים בדוגמאות, אבל זה הוא מסיס בהקסאן ומוסר במהלך פירוק מדגם מייד לפני ניתוח טרשת נפוצה. 3. ניתוח TAG ידי MALDI-TOF MS הכן פתרון מטריצה ​​α-Cyano-4-hydroxy-Cinnamic חומצה (CHCA) טרי על ידי המסת 10 CHCA מ"ג ב 1 מיליליטר ממס (אתנול 49.5%, אצטוניטריל 49.5% ו -1% 0.1% מימיים TFA). הכן את הורמון adrenocarticotropic (ACTH; 18-39 קליפ, 2465.1989 דא) לרזולוצית מכשיר ובדיקת רגישות על ידי ערבוב 1 μl של ACTH (1 מ"ג / מיליליטר) עם 39.5 μl של 0.1% חומצת trifluoroacetic (TFA) כדי להשיג 10 pmol / μl פתרון מניות. זה יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. הכן solut ACTH עובד טרייון (pmol 1 / μl) על ידי לקיחת 1 μl של 10 pmol / פתרון מניות μl, ערבוב עם 9 μl 0.1% TFA, ולאחר מכן ערבוב (1:1) עם 10 μl של פתרון מטריצת CHCA להשיג fmol 500 / ריכוז μl. הכנת תקני TAG ב10 מ"ג / מיליליטר ב3:02 C: M עבור כיול מכשיר MALDI (למשל tricaprin [470.361 דה], tricaprylin [554.455 דה], trilaurin [638.549 דה], tripalmitin [722.642 דה], tripalmitolein [800.689 דה] , Trimyristin [806.736 דה], triolein [884.783 דה], Tri-11-eicosenoin [968.877 דה], וtrierucin [1052.971 דה]). הכן triolein ב10 מ"ג / מיליליטר ב03:02 C: M עבור סטנדרטי TAG חיצוני נעילה המונית כיול. ממיסים את דגימות TAG מאוחסנות בהקסאן לפתרון 10 מ"ג / מיליליטר. הכן 0.5 M (77.06 mg/1.0 מיליליטר) פתרון מניות של חומצת 2,5-dihydroxybenzoic (DHB) עם מתנול 90% לשימוש כדוגמה, ומטריצה ​​סטנדרטית. גם להכין פתרון 1.0 M (2.0 מיליליטר g/50.0) של NaOH. כסה את הצינור עם פתרון DHB באמצעות FOI אלומיניום l כדי להגן מפני אור. מערבבים (בצינורות מראש שטף) 10.0 מטריצת μl DHB, מדגם μl 10.0 או רגיל, ו5.0 μl 1.0 M NaOH. מערבבים ובקצרה צנטריפוגות הצינור להביא תערובת לתחתית. ספוט 1.0 μl לסטנדרטים, לדוגמא, או ACTH על צלחת MALDI נירוסטה יעד ומקום בתא ייבוש עד יבש. מניחים את צלחת היעד למכשיר לרכישת נתונים. בצע MALDI-TOF MS ניתוחים במצב reflectron חיובי. מנגינה ולכייל את המכשיר כפי שתואר על ידי היצרן של המכשיר באמצעות ACTH ופתרונות סטנדרטיים TAG. רכישת ספקטרום עבור כל דגימה הבחינה בצלחת היעד (עולה בקנה אחד עם מפרט מכשיר; פרמטרים עבור עבודה זו היו 5 שיעור הרץ לייזר ירי, למקום ~ 100 יריות כדי לקבל ספקטרום ממוצע). לאחר ההחלקה וחיסור הרקע מספקטרום MALDI, פסגות יון התהליך באופן ידני עם שומני MAPS מנוע חיפוש המקוון (/ כלים / MS / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / כלים / MS / glycerolipids_batch). להעתיק ולהדביק את ספקטרום הרשימה לרשימה של יונים מבשר ותיבת אינטנסיביות. הגבל את החיפוש להרכב acyl הרצוי. זהה את תגיות על ידי המסה / מטען יחסים (m / z) מיונים נמצאים בספקטרום עבור כל דגימה. אם אחוזי תיל אסטר חומצת שומן (FAME) זמינים מניתוח נפרד GC / MS, להוסיף נתונים אלה כדי להשיג הסתברויות תגיות הווה. מכשיר: ספקטרומטר המסה השתמש במחקר זה הוא וטרס MALDI מייקר MX (מצויד ב20 N הרץ 2 לייזר ננומטר 337). יכול לשמש מכשיר MALDI כל יצרן עם יכולת מצב reflectron חיובית. הגדרות כלליות המשמשות הן מתח דופק, 2,000 V; reflectron, 5,200 V; מקור, 15,000 V, עם רכישת נתונים באמצעות תוכנת MassLynx (ver. 4.0). תנאי הפעלה אלה מספקים רזולוציה מסה גדולה מ 12,000.

Representative Results

שיטת החילוץ לבידוד שומנים הכולל מהרקמה שתוארה על ידי 30 Folch היא הליך פשוט, אשר מותאם לכאן. לאחר מיצוי רקמה ואידוי ממס, השומנים לעתים קרובות מופיעים כסרט צהבהב. הצבע הצהוב הוא ככל הנראה ממזהמי חלבון, אשר ניתן להסירו על ידי ביצוע מיצוי נוזל נוזל. עיבוד דגימה נוסף זו אין צורך בהליך זה משום TLC preparative מפריד שבריר TAG ממזהמים מסוג זה. התוספת של נתרן גופרתי נטול מים טריים בכל שלבי הסינון מסייעת בהפחתת זיהום מים שמשפיע על קביעות במשקל שומנים מדויקות. שומנים הכסות יונקים מנתחים ידי TLC preparative עם H: E: כשלב הנייד בדרך כלל יפתור את ארבע להקות שונות המתאימה (החל מהמקור) סטרולים, חומצות שומן חופשיות, תגיות, ואסטרים סטרולים / אסטרים שעווה / סקוואלין (איור 1). בהזדמנות בעת שימוש analytiביצועים גבוהים קאל (HP) TLC עם H: E: שלב נייד, אסטרים סטרולים, אסטרים דונגי, והסקוואלין יפרידו ויופיעו כשלוש להקות נפרדות. בתנאים ששמשו במחקר הנוכחי, אסטרים סטרולים / שעווה אינם מופרדים. אם להקות אלה הן בעלי עניין, השלב הנייד ניתן להעביר לisooctane: אתר אתיל (95:5 V / V), וצלחת HPTLC ניתן לנתח על ידי סריקת צפיפות. גורמים אחרים יכולים לגרום להפרדה לקויה. אלה הם בדרך כלל בוטלו על ידי הנחת נייר הסינון בתא, החלת גריז לחותם חזק על המכסה, equilibrating קאמרי הלילה, ושמירה על תאי TLC נקיים, כדי להשיג הפרדות TLC איכות עקבית ונתונים. ספקטרום המוני נציג MALDI-TOF מתקבל עבור תגיות מבודדות מהמחבט האדום המזרחי מוצג באיורים 2 ו -3. ספקטרום אלה מכילים פסגות יון TAG בטווח ההמוני בין m / z 850-910, אשר אופייני לתגיות מבודדות מיונק שאינו מימייםs. התוספת של 1.0 M NaOH מקדמת טעונה ביחידים יוני Na + כי הם יציבים יותר מ H + יונים. בנוסף ליציבות, ההיעדר של H + ו-K + יונים מגדיל להקל על ניתוח ספקטרום. מ '/ z 850-910 יון פסגות מתאימות ל16:00, 18:00, 18:1, 18:2 וmoieties FA מהווה את המרכיבים הדומיננטיים acyl בתגיות (טבלת 1). moieties FA האפשרי של תגיות ניתן תחילה נקבע על ידי נוכחים בסך הכל מ 'יון / z בMALDI-TOF MS ספקטרום, והבדלים בין מינים ואנשים הסיקו. עם זאת, אם היחסים הספציפיים של תוכן acyl נדרשים, ולאחר מכן MS / MS או גז כרומטוגרפיה (GC / MS) חייב להיות בשימוש. מידע נוסף על יחסי acyl ניתן להסיק על ידי התבוננות הפסגות באזור diacylglycerides של הספקטרום (איור 4). Diacylglycerides מיוצר מפיצול TAG במקור MALDI וניתן למצוא במ '/ z 590-650 האזור. פיצול TAG יכול להיות מוגבר על ידיהשמטת התוספת של 1.0 M NaOH 16. רקמת כנף עטלף אדום המזרחית מאופיינת בשיא דומיננטי במ '/ z 879.7 ורקמות שיער עם שיא דומיננטי במ' / z 881.8 (איור 2 ו -3 בהתאמה). פסגות במ '/ z 907.8, 879.7, ו855.7 (POP, PPOs) הן כ גם בעוצמה (~ 50%) ברקמת שיער עם השיא ב853.7 הוויה ~ 40%. הרכב הרכב יסודות Mass הנצפה תגיות Na + תגיות Na + SSO 57 C H 108 O 6 911.8 OOS, LSS 57 C H 106 O 6 909.8 OOO, LnSS, תזמורת סימפונית של לונדון C 57 H104 O 6 907.8 Loo, LLS 57 C H 102 O 6 905.8 Llo, OOLn 57 C H 100 O 6 903.7 LLL 57 C H 98 O 6 901.7 LLLn 57 C H 96 O 6 899.7 LLnLn 57 C H 94 O 6 897.7 LnLnLn 57 C H 92 O 6 895.7 OSP 55 C H 104 O 6 883.8 LSP, OOP, SOPo 55 C H 102 O 6 881.8 LOP, LnSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ Td> 879.7 LLP, LnOP, LOPo 55 C H 98 O 6 877.7 LnLP, LLPo, LnOPo 55 C H 96 O 6 875.7 LnLnP, LnLPo 55 C H 94 O 6 873.7 LnLnPo 55 C H 92 O 6 871.7 PPS 53 C H 102 O 6 857.8 POP, PPOs 53 C H 100 O 6 855.7 OOM, PPL, PoPoS, פופו 53 C H 98 O 6 853.7 PPLn, PPoL, PoPoO, MyOO 53 C H 96 O 6 851.7 התואר שני במשפטים, LnOM C 53 H 94 </sUB> O 6 849.7 PPP, SSLa 51 C H 98 O 6 829.7 PPPo, OSLa 51 C H 96 O 6 827.7 PPoPo, PMyO 51 C H 94 O 6 825.7 LnLnLa 51 C H 86 O 6 817.6 MMS, הסטירה, PPM 49 C H 94 O 6 801.7 SLaPo, PPoM, PPMy 49 C H 92 O 6 799.7 PoPoM, OOCa 49 C H 90 O 6 797.7 MMP 47 C H 90 O 6 773.7 MMPo, OCaP C 47 H 88 O6 771.7 OCaPo 47 C H 86 O 6 769.6 MMM, PPCa, PMLa 45 C H 86 O 6 745.6 PoPCa, PoMLa 45 C H 84 O 6 743.6 PoPoCa 45 C H 82 O 6 741.6 LaLaP, MMLa, MCaP 43 C H 82 O 6 717.6 LaLaPo 43 C H 80 O 6 715.6 OO 39 C H 72 O 5 643.5 OL 39 C H 70 O 5 641.5 LL 39 C H 68 O 5 639.5 SP 37 C H 72 O 5 619.5 OP 37 C H 70 O 5 617.5 LP 37 C H 68 O 5 615.5 טבלת 1. הרכב חומצות שומן, הרכב יסודות, ומסה של איזוטופים adducts sodiated של triacylglycerides וdiacylglycerides. = חומצת Ln ינולנית (18:03), L = חומצה לינולאית (18:02), מ = חומצה אולאית (18:01), S = חומצה סטארית (18:00), P = חומצה פלמיטית (16:00), פו = חומצת palmitoleic (16:01), M = חומצת myristic (14:00), = חומצת myristoleic שלי (14:1) La = lauric חומצה (12:00), Ca = חומצה קאפרית (10:00). איור 1. הכרומתוגרמה בשכבה דקה של הפרדה רחבה ברמת שומנים בדם על ידי הקסאן: אתר diethyl: חומצה אצטית(80:20:2 v / v / v) כשלב הנייד. הלהקה בין סטרולים ופ"א לא זוהתה על ידי תקן, אך עשוי להיות לאלכוהול שומן או diester שעווה. איור 2. אזור TAG המורחב של ספקטרום המוני MALDI-TOF של תגיות sodiated. (מ '/ z 700-950) מבת המזרח אדומה (הזוהר L.) רקמת אגף פיקס זוהה במ' / z 853.7 (OOM, PPL, PoPoS, פופו) ומטר / Z 879.7 (LOP, LnSP, LSPo). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 3. אזור TAG המורחב של ספקטרום המוני MALDI-TOF של תגיות sodiated (מ '/ z 700-950) מבת המזרח אדומה (הזוהר L.) רקמת שיער.פסגות זיהו במ '/ z 905.8 (שירותים, LLS) וm / z 907.8 (OOO, LnSS, תזמורת סימפונית של לונדון). לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה. איור 4. אזור DAG של ספקטרום MALDI-TOF ההמוני של שברי DAG sodiated (מ '/ z 530-730). רקמת כנף ממחבט אדום מזרחי (הזוהר L.) פיקס זוהה במ' / z 643.5 (OO) וm / z 615.5 (LP) . לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

מאמר זה מציג שיטה פשוטה וחזקה להפרדת כיתות שומנים רחבות מבודדות מintegument היונקים ידי TLC preparative וקביעת פרופילי TAG ידי MALDI-TOF MS, ללא derivatization של מולקולות השומנים זמן רב. השלבים הקריטיים בהפקת ספקטרום איכות תגיות עם MALDI-TOF MS כוללים: 1) חילוץ מוצלח של המתחם עם זיהום או חמצון מינימאלי; 2) הפרדה מספקת ובידוד על ידי כרומטוגרפיה: 3) ברזולוציה גבוהה ודיוק המוני על ידי MALDI-TOF טרשת נפוצה.

מסמך זה מדגים את השיטה על ידי מיצוי ומפריד את החלק היחסי של שומנים הניטרלי מplagiopatagium של המחבט האדום במזרח כדי להשיג פרופילי MS TAG. בעוד שהמחקר הנוכחי השתמש במיני עטלפים (יונקים: Chiroptera) ניתן להאריך בשיטות אלה כדי ללמוד שומני הכסות של כל מיני יונקים. integument בת מאופיין בהיותו בעיקר כולסטרול, עם כמויות נמוכות יותר של תגיות, חומצות שומן חופשיות, squaLene, וסטרולים / שעוות אסטרים. יחס שומנים החלב בעטלפים שונה מבני האדם בסקוואלין שהוא מצויה בכמויות נמוכות (בניגוד לעד 16% בבני אדם), ואילו כולסטרול מתרחש ביחסים גדולים יותר (1 – 7% בבני אדם אלא 26-62% בעטלפים) 22 , ביום 31. שערות אדם מכילות תגים כ -3%, ואילו יחסים עד 28% נמצאים בשיער מחבט אדום במזרח. החילוץ של דגימות שומנים מעטלפים הוא דומה למינים אחרים. בעוד שבמחקר זה כדורי צמר גפן טבול בחומר ממס משמשים כדי להסיר את חלב, אפשר גם להפוך צינור בקבוקון או מדגם המכיל ממס על פני השטח של מספר רב של פעמים integument. מוצרי קלטת מיוחדים גם לספק אמצעים חלופיים כדי לחלץ שומני משטח 32. חלק קריטי של שאיבת שומנים נכונה הוא למזער את הזיהום משמני עור. המטרה זו מושגת בקלות על ידי שמירה על בקבוק לחיץ עם מתנול וריסוס כל כלי הזכוכית וכלי, מנגב את הכלים עם רקמה בין כל הדגימות ובדיקה הכפפות לובשות. o חמצוןacyls רב בלתי רווי F הוא למנוע באמצעות התוספת של BHT, ויש להשתמש בו ללא קשר לטמפרטורה דגימות נשמרות ב.

ניתוח Biomolecule בדרך כלל דורש צעד chromatographic למולקולות נפרדות של ריבית ממזהמים. TLC משמש בשיטה זו, אשר תמנע דרישות מכשור לגז או כרומטוגרפיה נוזלית ודורשת ניסיון טכני פחות כדי להשיג תוצאות חזקות ודיר. בהתאם למחלקת השומנים של עניין, ניתן לשלב בשלבים שונים של התקנים ניידים רבים. יתר על כן, השימוש בצלחות HPTLC וצפיפות סריקה יכול לשמש כדי להשיג תוצאות כמותיות. בעוד הווריאציות של שיטות TLC הן רבות מדי לרשימה כאן, כמה שלבים ניידים נפוצים בשימוש בשומני TLC כוללים כלורופורם: מתנול: מים להפרדה של פוספוליפידים וglycolipids או isooctane: אתר אתיל להפרדת שומנים הלא קוטביים 28. במונחים של הפרדת תגיות מכיתות אחרות שומנים בדם, H: E: כל כךמערכת עובדת באופן עקבי lvent ומספקת תוצאות דומות.

יתרון נוסף לשימוש בTLC הוא שלהקות של עניין יכולות להיות צדודית במהירות באמצעות MALDI-TOF MS ללא derivatization המוקדם של analytes. במחקר זה סיליקה היא להסיר את צלחת TLC, ואנליטי הוא eluted ממנו על ידי sonication בצנטריפוגה ממס ולאחר מכן להפריד את כושר ספיגה ואידוי של ממס משחררי. לחלופין, מטריצה ​​עשויה להיות מיושמת ישירות על גבי להקות אנליטי מופרד על צלחות TLC ולאחר מכן ניתחו באופן ישיר על ידי MALDI-TOF MS 33. פרופיל מוצלח על ידי MALDI-TOF MS אין להסתמך על הכנת מדגם מספיק ומיומנות של המפעיל עם כוונון וכיול המכשיר. המכשיר צריך להיות מכויל יומי עם סטנדרטים כיסוי מתאים טווח משקל מולקולרי עבור המולקולות של עניין. גם הרגישות המתאימה והרזולוציה (למשל ≥ 10,000) של הציוד צריכה להיות confirmeד יומי עם ACTH.

שומנים מרכיבי החלב נמצאים על פני השטח של integument יונקים עשויים לשחק תפקיד בהתישבות על ידי פתוגנים פטרייתי / חיידקים. לכן ידע של ההרכב הכימי בין מינים ויחידים עשוי לספק רמזים על תהליכים של מחלות בבני אדם ובעלי חיים. הבדלי Intraspecific בקרב אנשים חולים ובריאים יכולים לייצג סימנים קליניים המסייעים בזיהוי מחלה ואבחון. יתר על כן, אם תרכובות מסוימות המעכבות התפתחותם של חיידקים נמצאות, אלה עשויים להיות מזוהים לשימוש בטיפול במחלות ומניעתן.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

סיוע שניתן על ידי סקוט Treece, Katelyn arter, ג'רמי Ragsdell, טוני LaMark ג'יימס, איימי פישר, חנה בלייר, ואיינו Gerdes במהלך הפיתוח של שיטות מעבדה. ברצוננו להודות למעבדת Medina-וליבר (לואיס H. Nopo-Olazabal; ארקנסו Biosciences מכון) לקבלת סיוע בצפיפות סריקת TLC. MALDI-TOF MS משמש עבור פרויקט זה סופק באמצעות NSF EPSCoR, RII: ארקנסו ASSET יוזמת מרכז P3 (EPS-0,701,890) בBiosciences ארקנסו המכון. מימון ניתן על ידי דיג בארה"ב וחיות הבר השירות / המדינה ארקנסו טבע גרנט, אגודת speleological הלאומית, והמרכז למחקר בצפון אמריקה בת ושימור באוניברסיטת מדינת אינדיאנה.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image