JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
español

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

Tegumento de los mamíferos contiene lípidos extraíbles con disolventes que pueden proporcionar composiciones química característica de las especies individuales. Este trabajo presenta un método de rutina para separar grandes clases de lípidos aislados de tejidos tegumentarios utilizando cromatografía en capa fina y la determinación del perfil triacilglicérido por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz.

Abstract

El tegumento de mamífero incluye glándulas sebáceas, que segregan un material aceitoso en la superficie de la piel. La producción de sebo es parte del sistema inmune innato que es de protección contra los microbios patógenos. La producción de sebo anormal y composición química son también un síntoma clínico de las enfermedades específicas de la piel. El sebo contiene una mezcla compleja de lípidos, incluyendo triglicéridos, que es específico de la especie. Las propiedades químicas generales expuestos por diversas clases de lípidos dificultan la determinación específica de la composición de sebo. Técnicas analíticas para los lípidos requieren típicamente derivatizaciones químicas que son Incremento Muestra costos de preparación de mano de obra intensiva y. Este artículo describe cómo extraer lípidos de tegumento de los mamíferos, clases de lípidos amplios separados por cromatografía en capa fina, y el perfil de los contenidos triacylglyceride utilizando la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser asistida por matriz / ionización. Este método robusto permite una determinación directade los perfiles triacylglyceride entre las especies y los individuos, y puede aplicarse fácilmente a cualquier grupo taxonómico de los mamíferos.

Introduction

Tejidos tegumentarios mamíferos incluyen la epidermis, las estructuras de queratina (por ejemplo, cabello y uñas) y las glándulas exocrinas. Glándulas exocrinas de tipo sebáceo están asociados con los folículos del pelo, que se denominan colectivamente como la unidad pilosebácea 1. Las glándulas sebáceas liberan un exudado oleosa sobre la superficie de la piel a que se refiere como sebo. El sebo se compone en gran parte de glicerolípidos (por ejemplo, triglicéridos [CTC]), acilos grasos libres (AGL), ésteres de esterol / cera, y escualeno. Composición química del sebo es específico de la especie 2. Además de ser parte del sistema inmune innato y proporcionar la función antimicrobiana 3, lípidos sebáceos afectan a importantes procesos fisiológicos incluyendo la pérdida por evaporación de agua a través de la piel 4, la integridad celular y la regulación de genes 5, y la absorción del fármaco 6. Composiciones de lípidos sebáceos también pueden servir como marcadores de la enfermedad. Proporciones y cantidades de sebácea b alteradosclases de lípidos de la carretera son signos clínicos de enfermedades tales como acné vulgaris 7, 8 la caspa, dermatitis seborreica 8, asteatosis 9, 10 entre otros. Tejidos epidérmicos y del pelo incluyen perfiles variables que contienen esteroles y derivados, las etiquetas, los AGL, ceramidas, fosfolípidos y otros componentes lipídicos menores. Debido a que los lípidos tegumentario pueden funcionar en los procesos de enfermedad, la determinación de diferencias en las composiciones químicas de los TG entre individuos sanos y enfermos puede ser útil para el diagnóstico clínico de la enfermedad.

Los lípidos se definen generalmente como compuestos orgánicos insolubles en agua con sustituyentes ya sea polar o no polar-polares 11. Estructuras lipídicas pueden ser cadenas largas de hidrocarburos, alcanos oxigenados (incluyendo ésteres de cera, ácidos grasos libres, alcoholes, cetonas, y aldehídos), o estructuras de anillo complejos tales como el colesterol 12. Hay ocho clases principales de lípidos basados ​​en la estructura (AGL, glycerolipids [GL], glicerofosfolípidos [GP], esfingolípidos [SP], lípidos esteroles [ST], lípidos prenol [PR], saccharolipids [SL], y policétidos [PK]), que exhiben una amplia gama de propiedades químicas en función de la clase 13. Debido a la amplia variación en las propiedades químicas de clases de lípidos, se desea perfiles directa sin derivatización antes de moléculas de lípidos. Uno de los métodos emergentes de investigación en lípidos es la cromatografía en capa fina (TLC), combinada con espectrometría de desorción por láser asistida por matriz / ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOF MS) 14.

MALDI-TOF MS se utiliza ampliamente en la investigación proteómica para identificar las proteínas y asociarlos a las secuencias de aminoácidos específicos debido a los iones de péptidos de masas "huellas digitales" de gran precisión generados a partir de las proteínas tripsina digerido 15. MALDI-TOF MS también se puede utilizar para el perfil de otras clases de biomoléculas, incluyendo lípidos tales como etiquetas 16-18. MALDI requiere el uso de una matriz, típcamente un compuesto orgánico que contiene estructuras de doble enlace y aromáticos conjugados. Las moléculas de la matriz sirven para transferir con cuidado la energía del láser para los analitos, promover la transferencia de protones, y producir iones en fase gaseosa sola carga 19-21. Los iones son sometidos a un campo de alto voltaje a alto vacío y se aceleraron en un analizador de masas TOF donde los iones se separan posteriormente por las diferencias en las velocidades que son proporcionales a sus relaciones masa-carga. Incluso las grandes biomoléculas pueden ser ionizados con poca fragmentación, la producción de especies de iones moleculares sola carga de análisis de espectro simplificado. La capacidad de analizar moléculas lipídicas directamente sin previa transformación ha promovido la adopción inmediata de MALDI-TOF MS en la investigación lipidomic 18.

Este trabajo presenta un método de rutina para aislar y analizar los lípidos tegumentarios del pelo, las secreciones sebáceas y plagiopatagium del murciélago rojo del Este (Lasiurus Borealis). Esto se utiliza para determinar las variaciones interespecíficas en Bat lípidos tegumentario para dilucidar el proceso de la enfermedad del síndrome de la nariz blanca (SNB) 22. WNS es una enfermedad fúngica de murciélagos y es causado por las especies recientemente descritas psicrofílicas Geomyces destructans 23-25. WNS ha causado la muerte de más de 5 millones de murciélagos de la cueva de América del Norte y amenaza la extinción de las especies de murciélagos vulnerables, con impactos económicos potenciales de miles de millones de dólares en daños a la industria agrícola 26,27. Para investigar los pasos de G. destructans la infección, se extrajeron los lípidos de los tejidos de pelo y de las alas de los murciélagos rojo del este y separados en clases de lípidos amplias por TLC para aislar la fracción de TAG para el posterior análisis por MALDI-TOF MS. TAGs contienen cadenas de acilo cortos y son fácilmente detectados por MALDI-TOF MS con poca interferencia de la matriz.

Protocol

PRECAUCIÓN: Obtenga por adelantado todos los permisos estatales y federales necesarios para el manejo, transporte y almacenamiento de los murciélagos. Las homologaciones también se deben obtener de su cuidado y uso de animales comité institucional, así como de su comité de bioseguridad institucional. Si los murciélagos vivos (o tejido del sistema nervioso) se deben manejar, cuidadores de animales deben ser vacunados contra la rabia. Murciélagos utilizados en el presente estudio se obtuvieron de la Selva Nacional Ozark San Francisco, CA, durante el verano de 2010 de acuerdo con los métodos estándar (de la Universidad Estatal de Arkansas Comité Institucional de Bioseguridad aprobación # 135349-1) 28. 1. Tejido Tratamiento y lípidos extracción Limpie todos los equipos con metanol antes y entre la recogida de tejidos de diferentes individuos. Recorte el pelo (aproximadamente 1,0 g) de la piel con unas tijeras y colocar en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Sebo muestra de la superficie del ala por la depuración de la piel con 4-6 bolas de algodón empapado de cloroformo,: Disolvente de metanol (C: M; 03:02 v / v), y colocarlos en un matraz separado. Extracto de tejido con 10 ml de C: M (02:01 v / v) que contiene 0,5% de hidroxitolueno butilado (BHT) para evitar la oxidación 29. Utilice únicamente disolventes de calidad HPLC. Después de 2 horas, añadir aproximadamente 0,5 g de sulfato anhidro a cada matraz, mezclar brevemente, y recoger el disolvente por filtración a través de papel de filtro. Repita los pasos 1,2 y 1,3 veces. Una vez con 1:1 C: M y secuencialmente con 01:02 C: M. Piscina filtrados juntos. Se evaporan los filtrados combinados bajo una corriente de N 2, determinar el peso seco, y disolver el residuo de lípidos en 03:02 C: M (con 0,5% de BHT) a una concentración de 10 mg / ml. No conserve la muestra en viales de vidrio a -20 ° C. En general, es mejor analizar las muestras dentro de un mes después de la toma de la muestra y para reducir al mínimo los ciclos de congelación-descongelación. 2. Lípido La separación por cromatografía preparativa en capa fina Preparar con antelación solvente lavada 1,5 ml microcentrifuge tubos de llenado con 03:02 C: M, enjuagando con acetona, y secado al aire. Esto se hace para eliminar los plastificantes que pueden interferir con el análisis de espectrometría de masas más tarde. Almacene los tubos de muestra en un recipiente libre de polvo y manejar estos tubos sólo con guantes para evitar la contaminación de los aceites de la piel. Active la placa de TLC por primera pre-desarrollo con 03:02 C: M. Añadir suficiente disolvente a la cámara de TLC a una profundidad de 1 cm, a continuación, colocar la placa en la cámara (cerca con tapa de vidrio) y dejar que el disolvente para ejecutar completamente a la parte superior de la placa. Esto tarda unos 45 min. Retire la placa y secar en una campana de extracción hasta que se evapora el disolvente (aproximadamente 15 minutos), y echarlo en un horno durante al menos 10 minutos a 120 ° C. Coloque una marca de lápiz en la parte superior de la placa para mantener la orientación cuando se aplican las muestras. Coloque una línea de lápiz recto, 1,5 cm del borde inferior de la placa, para marcar la línea de base donde se colocarán la muestra y los estándares. Prepare la cámara TLC cortando unapedazo de papel de filtro lo suficientemente grande como para alinear las dos paredes cortas y una larga pared. Coloque el forro de papel de filtro en la cámara. Será totalmente mojado cuando se añade disolvente a la cámara. Preparar 100 ml de la fase móvil disolvente, que es hexano: éter dietílico: ácido acético (H: E: Un; 80:20:2 v / v / v). Vierta disolvente en la cámara para dar una profundidad de aproximadamente 1 cm. Cubrir con la tapa de vidrio, con un sello de grasa de silicona a lo largo del borde superior de la cámara. Dejar que la cámara de equilibrar durante la noche antes de su uso. Aplicar la muestra manualmente a la placa preparada con un tubo capilar o una pipeta como una raya continua de aproximadamente 1,5 cm desde un borde hasta 1,5 cm hasta el otro borde. Se prefiere un aplicador automático de muestras, ya que se carga la muestra en una racha más homogénea. Utilice los carriles exteriores de la placa de TLC de detectar cerca de 20 l de mezcla de esteroles, ácidos grasos libres, las etiquetas y las normas de éster de esterol (uso de 10 mg / ml; mezclas prefabricadas se pueden obtener). Coloque la placa de TLC cargado enla cámara de equilibrado, cerrar con la tapa, y desarrollar la placa hasta que el disolvente se dirige hacia el borde superior. Esto toma alrededor de 45 minutos con la fase móvil se describe aquí. Retire la placa de la cámara y deje que el exceso de disolvente se evapore de la placa en una campana de humos durante aproximadamente 1 min. Rocíe con un 0,05% rodamina 6G en etanol al 95%. Visualice bandas de lípidos bajo una lámpara ultravioleta de longitud de onda larga. Marque con un lápiz la posición f R para las bandas fluorescentes resueltas en la muestra y los estándares. Un registro fotográfico se puede tomar en este punto. Identificar la banda correspondiente a la norma TAG y sacarlo de la placa raspando la sílice con una espátula en una hoja grande de papel cristal sopesar papel. Transferencia de sílice a un tubo de microcentrífuga-disolvente se lavó 1,5 ml. Añadir 1,0 ml de 03:02 C: M disolvente para el tubo de muestra, se somete a ultrasonidos durante 1 min, Pellet la sílice por centrifugación, y luego transferir el disolvente a un tubo nuevo previamente pesado. Repita ªe paso anterior, mancomunar los filtrados, y se evapora el disolvente bajo una corriente de N2. Guarde el residuo seco que contiene TAGs bajo N 2 en la oscuridad a 4 ° C, mientras que las muestras de tejido adicionales están separados por TLC. Rodamina 6G está presente en las muestras, pero es insoluble en hexano y se retira durante la disolución de la muestra inmediatamente antes del análisis de MS. 3. Análisis TAG por MALDI-TOF MS Preparar una solución de matriz fresco α-ciano—hidroxi cinámico ácido 4 (CHCA) mediante la disolución de 10 mg de CHCA en 1 ml de disolvente (etanol 49,5%, 49,5% de acetonitrilo, y 1% acuosa 0,1% de TFA). Preparar la hormona adrenocarticotropic (ACTH; 18-39 clip, 2465,1989 Da) para la resolución del instrumento y las pruebas de sensibilidad mediante la mezcla de 1 l de ACTH (1 mg / ml) con 39,5 l de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) para obtener un 10 pmol / l solución madre. Esto puede ser almacenado a -20 ° C para su uso futuro. Prepare una fresca solut ACTH trabajode iones (1 pmol / l) mediante la adopción de 1 l de la solución de stock 10 pmol / l, se mezcla con 9 l 0,1% de TFA, y luego la mezcla (01:01) con 10 l de la solución matriz de CHCA para obtener un fmol 500 / concentración l. Preparar normas de etiqueta en 10 mg / ml en 03:02 C: M para la calibración de instrumentos MALDI (por ejemplo tricaprina [470.361 Da], tricaprilina [554.455 Da], trilaurina [638.549 Da], tripalmitina [722.642 Da], tripalmitoleína [800.689 Da] , trimiristina [806.736 Da], trioleína [884.783 Da], tri-11-eicosenoin [968.877 Da] y trierucin [1052.971 Da]). Preparar trioleina a 10 mg / ml en 03:02 C: M para una norma TAG calibración bloqueo masivo externo. Disolver las muestras de las marcas almacenados en hexano a una solución de 10 mg / ml. Prepare un 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) solución madre de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) con 90% de metanol para su uso como muestra y matriz estándar. También hay que preparar una solución 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) de NaOH. Cubra el tubo con solución DHB usando foi aluminio l para protegerlo de la luz. Mezcla (en tubos de pre-lavado) 10,0 l de matriz DHB, 10,0 l de muestra o patrón, y 5,0 l 1,0 M de NaOH. Mezclar y centrifugar brevemente el tubo para llevar la mezcla a la parte inferior. Punto 1.0 l de estándar, muestras, o ACTH en una placa de MALDI objetivo de acero inoxidable y el lugar en un desecador hasta que se seque. Coloque la placa del objetivo en el instrumento para la adquisición de datos. Realice MALDI-TOF MS análisis en modo reflectrón positivo. Tune y calibrar el instrumento como se describe por el fabricante del instrumento utilizando la ACTH y soluciones estándar TAG. Adquirir espectros para cada muestra en la placa, blanco (compatible con las especificaciones del instrumento; parámetros para este trabajo fueron 5 tasa de disparos láser Hz, ~ 100 disparos por lugar de obtener un espectro promedio). Después de alisar y restando el fondo de los espectros MALDI, picos de iones proceso de forma manual con el motor de búsqueda en línea LIPID MAPAS (/ Tools / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch). Copie y pegue la lista de espectros en la lista de los iones precursores y caja de intensidad. Limitar la búsqueda a la composición acilo deseado. Identificar etiquetas de la masa / carga (m / z) relaciones de iones presentes en el espectro para cada muestra. Si éster metílico de ácido graso (FAME) porcentajes están disponibles a partir de análisis de GC / MS separado, añadir estos datos para obtener las probabilidades de los TG presentes. INSTRUMENTO: El espectrómetro de masas utilizado en este estudio es un Waters MALDI Micro MX (equipado con una nm 20 Hz N 2 láser 337). Instrumento MALDI de cualquier fabricante con capacidad de modo reflectrón positiva se puede utilizar. Ajustes generales utilizados son tensión de impulso, 2000 V; reflectrón, 5200 V, fuente, 15.000 V, con la adquisición de datos utilizando el software MassLynx (ver. 4.0). Estas condiciones de funcionamiento proporcionan una resolución de masa superior a 12.000.

Representative Results

El método de extracción para el aislamiento de lípidos totales a partir de tejido descrito por Folch 30 es un procedimiento sencillo, que está adaptado aquí. Después de la extracción de tejido y evaporación del disolvente, los lípidos a menudo aparecen como una película de color amarillento. El color amarillo más probable es de contaminantes de proteínas, que pueden ser eliminados mediante la realización de una extracción líquido-líquido. Este procesamiento de la muestra adicional no es necesario en este procedimiento debido a TLC preparativa separa la fracción de TAG de tales contaminantes. La adición de sulfato de sodio anhidro fresco en todas las etapas de filtrado ayuda a reducir la contaminación del agua que afecta a las determinaciones de peso de lípidos precisos. Lípidos tegumentario mamíferos análisis por TLC preparativa con H: E: A como la fase móvil por lo general se resolverá cuatro bandas distintas que corresponden a (a partir del origen) esteroles, ácidos grasos libres, las etiquetas y los ésteres de esterol / ésteres de cera / escualeno (Figura 1). En ocasiones cuando se utiliza analíticaalto rendimiento cal (HP) TLC con el H: E: Una fase móvil, los ésteres de esteroles, ésteres de cera, y el escualeno se separará y aparecen como tres bandas separadas. En las condiciones utilizadas en el presente estudio, los ésteres de esterol / cerosos no están separados. Si estas bandas son de interés, la fase móvil se puede cambiar a isooctano: éter etílico (95:5 v / v), y la placa de HPTLC se puede analizar por densitometría de barrido. Otros factores que pueden provocar una mala separación. Estos son generalmente eliminados colocando el papel de filtro en la cámara, la aplicación de grasa para un sello hermético en la tapa, equilibrar la cámara durante la noche, y de mantenimiento de cámaras de TLC limpias, para obtener una calidad constante separaciones y los datos de TLC. Representante espectros de masas MALDI-TOF obtenido para TAGs aislados del murciélago rojo del Este se muestran en las figuras 2 y 3. Estos espectros contienen picos de iones de TAG en el rango de masas entre m / z 850 a 910, que es típico de TAGs aisladas de mamífero no acuáticos. La adición de 1,0 M de NaOH promueve una sola carga iones Na + que son más estables que los iones H +. Además de la estabilidad, la ausencia de H + y K + iones aumenta la facilidad de análisis de espectro. El m / z 850-910 iones picos corresponden a 16:00, 18:00, 18:01, y 18:02 restos FA constituyan el acilo dominantes en TAGs (Tabla 1). Posibles restos de FA de TAGs se pueden determinar inicialmente por el total de iones m / z presente en MALDI-TOF MS espectros, y las diferencias entre las especies y de los individuos que se deducen. Sin embargo, si se requiere que las razones dadas por el contenido de acilo, entonces se deben utilizar MS / MS o la cromatografía de gases (GC / MS). Más información sobre relaciones de acilo se puede deducir mediante la observación de los picos en la región diacilglicéridos del espectro (Figura 4). Diacilglicéridos se producen a partir de la fragmentación TAG en la fuente MALDI y se pueden encontrar en el m / z 590-650 región. La fragmentación de TAG se puede aumentar poromitiendo la adición de 1,0 M de NaOH 16. Tejido ala de murciélago rojo oriental se caracteriza por un pico dominante a m / z 879,7 y el tejido de pelo con un pico dominante a m / z 881.8 (Figura 2 y 3 respectivamente). Los picos am / z 907,8, 879,7, y 855,7 (POP, PPO) son aproximadamente iguales en intensidad (~ 50%) en los tejidos de pelo con el pico a 853,7 ser ~ 40%. Composición Composición Elemental Masa Observada TAGs Na + TAGs Na + SSO C 57 H 108 O 6 911,8 OOS, LSS C 57 H 106 O 6 909.8 OOO, LNSS, LSO C 57 H104 O 6 907,8 LOO, LLS C 57 H 102 O 6 905.8 LLO, OOLn C 57 H 100 O 6 903.7 LLL C 57 H 98 O 6 901.7 LLLn C 57 H 96 O 6 899.7 LLnLn C 57 H 94 O 6 897.7 Lnlnln C 57 H 92 O 6 895.7 OSP C 55 H 104 O 6 883.8 LSP, programación orientada a objetos, Sopó C 55 H 102 O 6 881.8 LOP, LNSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ Td> 879.7 LLP, LNOP, Lopo C 55 H 98 O 6 877.7 LnLP, LLPo, LnOPo C 55 H 96 O 6 875.7 LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873.7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7 PPS C 53 H 102 O 6 857.8 POP, PPO C 53 H 100 O 6 855,7 OOM, PPL, Popos, Popo C 53 H 98 O 6 853.7 PPLN, ppol, Popoo, Myoo C 53 H 96 O 6 851.7 LLM, Lnom C 53 H 94 </sub> O 6 849.7 PPP, SSLA C 51 H 98 O 6 829,7 PPPO, Osla C 51 H 96 O 6 827.7 PPoPo, PMyO C 51 H 94 O 6 825.7 LnLnLa C 51 H 86 O 6 817,6 MMS, Slap, PPM C 49 H 94 O 6 801.7 SLaPo, PPOM, PPMy C 49 H 92 O 6 799,7 PoPoM, OOCA C 49 H 90 O 6 797,7 MMP C 47 H 90 O 6 773.7 MMPo, OCAP C 47 H 88 O6 771.7 OCaPo C 47 H 86 O 6 769,6 MMM, PPCa, PMLA C 45 H 86 O 6 745.6 PoPCa, PoMLa C 45 H 84 O 6 743.6 Popoca C 45 H 82 O 6 741.6 LaLaP, MMLA, mCAP C 43 H 82 O 6 717.6 LaLaPo C 43 H 80 O 6 715.6 OO C 39 H 72 O 5 643.5 OL C 39 H 70 O 5 641.5 LL C 39 H 68 O 5 639,5 SP C 37 H 72 O 5 619.5 OP C 37 H 70 O 5 617.5 LP C 37 H 68 O 5 615,5 Tabla 1. Composición de ácidos grasos, composición elemental, y la masa isotópica de aductos sodiated de triacilglicéridos y diacilglicéridos. Ln = ácido linolénico (18:3), L = ácido linoleico (18:2), O = ácido oleico (18:1), S = ácido esteárico (18:0), P = ácido palmítico (16:00), Po = ácido palmitoleico (16:1), M = ácido mirístico (14:00), Mi = ácido miristoleico (14:01) La = láurico ácido (12:00), Ca = ácido cáprico (10:00). Figura 1. Cromatograma en capa fina de amplia separación de clases de lípidos por hexano: éter dietílico: ácido acético(80:20:2 v / v / v) como la fase móvil. La banda entre esterol y FFA no fue identificado por un estándar, pero puede ser un alcohol graso o cera diéster. Figura 2. Región TAG Ampliado de MALDI-TOF espectro de masas de TAGs sodiated. (M / z 700 a 950) de murciélago rojo del Este (L. borealis) tejido ala Peaks identificados a m / z 853,7 (OOM, PPL, Popos, Popo) ym / z 879,7 (LOP, LNSP, LSPo). Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 3. Región TAG Ampliado de MALDI-TOF espectro de masas de TAGs sodiated (m / z 700 a 950) de murciélago rojo del Este (L. borealis) tejido de cabello.Los picos identificados en m / z 905,8 (LOO, LLS) ym / z 907,8 (OOO, LNSS, LSO). Haz click aquí para ver más grande la figura . Figura 4. Región DAG de MALDI-TOF espectro de masas de los fragmentos del DAG sodiated (m / z 530 a 730). Tejido de murciélago rojo del Este (L. borealis) ala Peaks identificados a m / z 643,5 (OO) y m / z 615,5 (LP) . Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discussion

En este trabajo se presenta un método simple y robusto para separar grandes clases de lípidos aislados de tegumento de los mamíferos por TLC preparativa y la determinación de los perfiles de TAG por MALDI-TOF MS, sin derivatización mucho tiempo de las moléculas de lípidos. Los pasos críticos en la producción de los espectros de la calidad de TG con MALDI-TOF MS incluyen: 1) la extracción con éxito del compuesto con un mínimo de contaminación u oxidación; 2) la separación suficiente y el aislamiento por cromatografía, y 3) de alta resolución y precisión de masa MALDI-TOF MS.

En este trabajo se muestra el método de extracción y separación de la fracción de lípidos neutros desde el plagiopatagium del murciélago rojo del Este para obtener TAG perfiles. Aunque el presente estudio se utilizó una especie de murciélagos (Mammalia: Chiroptera), estos métodos pueden extenderse para estudiar los lípidos tegumentarios de cualquier especie de mamífero. Tegumento Bat se caracteriza por ser predominantemente colesterol, con menores cantidades de TAGs, AGL, squalene y ésteres de esterol / cera. Proporciones de lípidos de sebo en los murciélagos difieren de los seres humanos en que el escualeno está presente en bajas cantidades (en oposición a un máximo de 16% en los seres humanos), mientras que el colesterol se produce en proporciones más grandes (1 – 7% en los seres humanos, pero 26-62% en los murciélagos) 22 , 31. Pelos humanos contienen aproximadamente el 3% TAGs, mientras que proporciones de hasta 28% se encuentran en murciélago rojo oriental pelo. La extracción de muestras de lípidos de los murciélagos es similar para otras especies. Mientras que en este estudio bolas de algodón empapadas en disolvente se usan para eliminar el sebo, también se puede invertir un tubo o vial de muestra que contiene disolvente sobre la superficie del tegumento múltiples veces. Productos de cinta especializadas también ofrecen medios alternativos para extraer lípidos de la superficie 32. Una parte crítica de una extracción de lípidos adecuada es para minimizar la contaminación de aceites de la piel. Esto se logra fácilmente, manteniendo un frasco con metanol y rociar toda la cristalería y utensilios de cocina, limpiando los utensilios con un tejido entre todas las muestras y el uso de guantes de examen. La oxidación oacilos poliinsaturados f se previene a través de la adición de BHT, y deben ser utilizados con independencia de la temperatura de las muestras se almacenan en.

Análisis de Biomoléculas lo general requiere un paso cromatográfico para separar las moléculas de interés de los contaminantes. TLC se utiliza en este método, lo que evita los requisitos de instrumentación para gases o cromatografía líquida y requiere menos experiencia técnica para lograr resultados robustos y repetibles. Dependiendo de la clase de lípidos de interés, muchos diferentes fases móviles se pueden incorporar. Además, el uso de placas de HPTLC y densitometría de barrido se puede usar para lograr resultados cuantitativos. Mientras que las variaciones de los métodos de TLC son demasiado numerosas para enumerarlas aquí, algunas fases móviles comunes utilizados en lípidos TLC incluyen cloroformo: metanol: agua para la separación de fosfolípidos y glicolípidos o isooctano: éter etílico para la separación de los lípidos no polares 28. En cuanto a la separación de TAGs de otras clases de lípidos, el H: E: A tansistema lvent trabaja constantemente y proporciona resultados comparables.

Otra ventaja para el uso de TLC es que las bandas de interés se pueden perfilar rápidamente usando MALDI-TOF MS sin derivatización previa de los analitos. En este estudio la sílice se elimina de la placa de TLC, y el analito se eluye de ella por sonicación en un disolvente y la posterior centrifugación para separar el adsorbente y la evaporación del disolvente de elución. Alternativamente, la matriz se puede aplicar directamente sobre las bandas de analitos separados en placas de TLC y después se analizó directamente por MALDI-TOF MS 33. Perfiles de éxito por MALDI-TOF MS no confían en la preparación de muestras suficientes y la competencia del operador con el ajuste y la calibración del instrumento. El instrumento debe ser calibrado diariamente con los estándares que cubren molecular rango de peso adecuado para las moléculas de interés. La sensibilidad y la resolución adecuada (por ejemplo ≥ 10.000) de los equipos también deben confirméD al día con ACTH.

Los constituyentes lipídicos sebáceas que se encuentran en la superficie del tegumento de mamíferos pueden desempeñar un papel en la colonización por patógenos bacterianos / hongos. Por lo tanto el conocimiento de la composición química entre las especies y de los individuos puede proporcionar pistas sobre los procesos de enfermedades humanas y la vida silvestre. Diferencias intraespecíficas entre los individuos sanos y los enfermos pueden representar signos clínicos que ayudan en la detección y diagnóstico de enfermedades. Además, si los compuestos específicos que inhiben el crecimiento microbiano están presentes, estos pueden ser identificados para su uso en el tratamiento y prevención de enfermedades.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Asistencia fue proporcionada por Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, y Cheyenne Gerdes durante el desarrollo de los métodos de laboratorio. Nos gustaría dar las gracias al Laboratorio de Medina-Bolívar (Luis H. Ñopo-Olazábal; Arkansas Biosciences Institute) para obtener ayuda con TLC escaneo de densitometría. MALDI-TOF MS utilizado para este proyecto fue proporcionado por la NSF EPSCoR, RII: Iniciativa ASSET Arkansas P3 Center (EPS-0701890) en el Instituto de Biociencias de Arkansas. El financiamiento fue proporcionado por una de Pesca y Vida Silvestre del Servicio / Arkansas State Vida Silvestre Grant, la Sociedad Nacional de Espeleología, y The Center for American Bat Investigación Norte y Conservación de la Universidad Estatal de Indiana.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image