Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso

1. Dissezione Soluzione salina scarafaggio utilizzata in questo protocollo ha la seguente composizione: Cockroach soluzione salina 36: (grammi per 100 ml) 210 mM NaCl (1.227 g) 2.9 mM KCl (0,0216 g) 1.8 mM CaCl 2 (0,0265 g) 0.2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1.8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7.2. Regolare il pH con 1 M NaOH o 1 M HCl). Selezionare uno scarafaggio maschio dalla serbatoio che ha robuste Cerci (Figura 1). Gli ultimi segmenti del maschio sono strette rispetto alla femmina, e non contenenti ovaie e massa uovo, i maschi sono più facili da sezionare. I maschi di P. americana hanno un paio di short stili tra i cerci. Questi stili non sono osservati nelle femmine. Tagliare le ali, le gambe e la testa e il pin del corpo, ventrale rivolta verso l'alto, ad una dish allineato con elastomero di silicone. Con pinze raccogliere le piastre ventrali e tagliarli fuori con le forbici sottili, a partire dalla fine posteriore e di lavoro anteriormente. Tenere sempre gli organi interni umido con soluzione salina, cercando di mantenere il cerci asciutto. Si può utilizzare cera o pezzi di gomma per posizionare gli addome verso l'alto per evitare che la soluzione salina dalla bagnando il cerci. Se non si bagnano, asciugarle con un pezzo di carta velina. Premere il lato gli organi interni e la materia bianca (grasso corporeo). Il VNC è al centro del campo, corre lungo l'addome e dovrebbe essere visibile tra le trachee lucido. Il cordone nervoso è trasparente e può inizialmente essere difficile da vedere finché l'illuminazione è regolata correttamente (Figura 2). NON maneggiare il VNC con una pinza o perni di insetti, invece manipolarla con sonde di vetro. Sgombrare il sistema trachee dell'animale nel miglior modo possibile dal cordone nervoso con una pinza e con un paio di bisogno buon bicchiereles, con molta attenzione contempla i connettivi VNC longitudinalmente tra A6 e A5 o A5 e A4 gangli (Figura 3). Culla della cerci e l'addome verso l'alto fuori dalla vasca salina con perni di insetti accorciato e cera o un cuneo di elastomero di silicone che può essere tagliato per adattarsi alla preparazione (Figure 4A e B). Prestare la massima attenzione nel segmento addominale ultima a non danneggiare i nervi Cercal che proiettano nel ganglio (figure 2D e 5). 2. Registrazione extracellulare La preparazione, microscopio, e la registrazione apparecchio sezionato dovrebbe essere impostato all'interno di una gabbia di Faraday, in particolare per bloccare AC, campi elettrici esterni che potrebbero ignorare segnali dai neuroni (Figura 6). Posizionare il microscopio in modo che si affaccia sul palco microscopio. Una volta che il preparato viene posto sul piatto, regolare la posizione del fascio ad alta intensità illuminatoreper un'ottima visualizzazione di esso. Collegare l'amplificatore differenziale AC / DC per l'unità di registrazione integrata di dati (informazioni dettagliate sulle impostazioni hardware e software specifici sono stati precedentemente descritto 25). Lo stadio testa in possesso di un elettrodo di aspirazione deve essere collegato all'amplificatore. Un filo di terra argento che è stato rivestito con Cl – inserito nei risultati addome in registrazioni più stabili. La ragione è che se la soluzione nella cavità del corpo non è a contatto con il fluido di balneazione nel piatto, il fluido associato con l'elettrodo di registrazione rimane a terra. Impostare la frequenza di registrazione a 4 kHz. Impostare la scala di tensione (asse y) a 500 mV (questo può essere regolata per ottimizzare la visualizzazione della traccia). Eseguire il software di registrazione in modalità continua o oscilloscopio per registrare l'attività neurale in risposta agli stimoli. Tagliare uno dei connettivi VNC vicino alla A5 e posizionare l'estremità tagliata collegato a A6 in un elettrodo di aspirazione. Assicurati di pull salina nel elettrodo di aspirazione a coprire il filo d'argento al suo interno prima di succhiare nel nervo. Con una pipetta soffio d'aria secca a peli situati su ogni cercus. Vedere se stimolando i peli sul omolaterale cercus al connettivo registrato dà una risposta diversa da quella controlaterale. Prendere atto dell'ampiezza delle risposte e il numero di punte in un dato intervallo di tempo durante la stimolazione. Spostare l'elettrodo di aspirazione ad un nervo Cercal per la registrazione. Per ottenere una migliore vestibilità, passa a un elettrodo con una minore apertura, se necessario. Tagliare il nervo vicino Cercal a A6 e poi aspirare il nervo che porta alla cercus. Ci dovrebbe essere scarica spontanea dei potenziali d'azione. Ora, soffiare aria sul cercus e annotare le risposte. 3. Elettricamente Stimolare i nervi sensoriali per determinare Recruitment Cambiare il software di registrazione in modalità a spazzare in modo che registra le tracce (100-500 MSEc.) ogni volta che uno stimolo viene attivato. Collegare l'elettrodo stimolante all'uscita dello stimolatore. Collegare il cavo stimolatore con i due cavi mini-gancio o clip. Collegare l'uscita del trigger BNC dallo stimolatore per l'ingresso trigger sull'unità di registrazione. I seguenti parametri di stimolazione dovrebbe evocare una risposta: Durata: 0,3 sec; Delay: 10 msec; frequenza: 1 Hz; Tensione: regolare come necessario per ottenere un segnale nelle registrazioni (poco più di soglia e di essere in grado di ottenere una risposta massima). Non c'è motivo di andare a tensioni molto più alte della soglia massima per l'assunzione come alta tensione può essere dannoso per il nervo. Tagliare il nervo cercal come distale possibile in modo che una lunga radice nervosa può essere tirato nel elettrodo di aspirazione stimolante (Figura 7, freccia testa). Il connettivo tra A6 e A5 o altro segmento più anteriore può essere utilizzato. Impostare l'elettrodo di aspirazione di registrazione in modo da poter pull una connettivo tagliato l'elettrodo. Assicurati di tirare qualche soluzione salina nelle elettrodi di aspirazione per coprire il filo d'argento al suo interno prima di succhiare nei nervi. Assicurarsi che l'elettrodo stimolante è anche radicata nella salina bagno (nell'addome vicino A3 è l'ideale). Fornire una serie di singoli stimoli di crescente tensione finché non appare un potenziale d'azione sullo schermo. Si dovrebbe fare una registrazione della minima tensione stimolante e la durata di reclutare una risposta. Aumentare l'intensità fino a quando si osserva una risposta sinaptica nei connettivi. Il grande spike (AP extracellulari) dagli assoni giganti appare per la prima, e poi altri più piccoli AP può anche essere osservato.