Neurale Opnemen vanaf een Intact Cockroach zenuwstelsel
Summary
Dit artikel beschrijft de kakkerlak buikzenuwkoord dissectie en extracellulaire opnames van de Cercal zenuw en voegwoorden. Opgeroepen reacties worden opgewekt door elektrische stimulatie van de Cercal zenuw of direct mechanische stimulatie van de cerci.
Abstract
De kakkerlak buikzenuwkoord voorbereiding is een handelbaar systeem voor neuroethology experimenten, neuraal netwerk modelleren en testen van de fysiologische effecten van insecticiden. Dit artikel beschrijft het toepassingsgebied van kakkerlak sensorische modaliteiten die kunnen worden gebruikt om te testen hoe een insect zenuwstelsel aan milieu verstoringen. Nadruk ligt hier op het vluchtgedrag gemedieerd door cerci tot reusachtige vezeltransmissie in Periplaneta americana. Deze in situ voorbereiding vergt slechts matig ontleden vaardigheid en elektrofysiologische expertise om reproduceerbare opnames van neuronale activiteit genereren. Peptiden of andere chemische stoffen kunnen dan direct op het zenuwstelsel in oplossing met fysiologische zoutoplossing. Insecticiden kunnen ook worden toegediend voorafgaand aan dissectie en de ontsnapping circuit kan dienen als een proxy voor de opgewonden toestand van het centrale zenuwstelsel. In dit verband is de hierin beschreven assays zou ook nuttig tot zijn researchers geïnteresseerd in de ledematen regeneratie en de evolutie van de ontwikkeling van het zenuwstelsel, waarvoor P. americana is een gevestigde modelorganisme.
Introduction
Er zijn meer dan 4.000 kakkerlak soorten maar slechts ongeveer 30 zijn bekende ongedierte. Misschien wel de meest bekende is de verkeerde naam Amerikaanse kakkerlak Periplaneta americana die is ontstaan in Afrika, en is nu bijna overal op de planeet gevonden. Naast de snelle loopsnelheid 1 en ontwijkend gedrag in de tropen P. americana in staat is de vlucht 2,3.
De overheersende kenmerken van de kakkerlak centrale zenuwstelsel (CNS) zijn de segmentering en decentralisatie van de controle processen 4,5. De hersenen, borstkas en buik ganglia zijn met elkaar verbonden door gepaarde interganglionic connectieven aan de buikzenuwkoord (VNC) te vormen.
De ganglia bij elk segment zijn het integreren. Ze zijn samengesteld uit een buitenste corticale gebied dat die verantwoordelijk zijn voor de bloed-hersen barrière permeabiliteit net onder stellen en de somata van neuronen oorsprongsprong uit dat ganglion. Deze somata kunnen behoren tot interneuronen, modulerende neuronen, of motorische neuronen. Zij leveren axonen dat binnen het ganglion van herkomst (lokale interneuron) blijven, of axonen die projecteren tussen de ganglia van de CNS (interganglionic interneuronen) of die eindigen op perifere spiercellen (motor neuronen). De meeste somata worden ventraal of ventrolaterally gepositioneerd in het ganglion cortex 5. De gepaarde, interganglionic connectieven bevatten slechts axonen en geen neuronale cellichamen.
De neuropil van een ganglion bevat gliacellen (neuroglia), axon traktaten, bundels van axonen en dendrieten (neurites) van neuronen. De neuropil is verstoken van neuronale cellichamen. Dit is het gebied binnen de ganglion waar directe synaptische communicatie tussen zenuwcellen en de integratie van inputs optreden.
Het vermogen van de Amerikaanse kakkerlak P. americana te sporen en plotseling reageren op een naderende predator (voet, hand, enz.) is toegewezen aan een reflex circuit dat bestaat uit de cerci en gigantische vezelsysteem 6,7. De cerci zijn een paar hoornachtige, wind-gevoelige structuren op het uiteinde van de buik (figuur 1). In P. americana het ventrale oppervlak van elke cercus bevat ongeveer 200 filiform (draad) haren die zijn geordend in 14 kolommen. Negen van deze kolommen consistent te zijn in verschillende dieren volgens het responseigenschappen van de bijbehorende receptor cel en axon. Elke haar in een socket die het mogelijk maakt om het gemakkelijkst buigen in een vlak dat specifieke kolom. Beweging van het haar in een richting langs zijn vliegtuig veroorzaakt een depolarisatie in de receptor cel en een uitbarsting van actiepotentialen (AP's) in de sensorische neuron. Beweging in de tegenovergestelde richting remt eventuele lopende spontane AP 8. De voorkeur vlak van vervorming en gerichtheid van de reactie verschilt in elke kolom. Aldus de filiform hair-receptorcomplexen niet alleen verantwoordelijk voor het detecteren van de beweging van lucht, maar ook "codering", in de vorm van AP, de richting van waaruit de luchtstroom ontstaan. Verwerking van deze informatie door de CNS resulteert in een 'passende' escape response 6,7. Deze functionele, zuilvormige specificiteit van de sensorische haren is bewaard gebleven van dier tot dier.
De receptor cel van elk filoremische haar is verantwoordelijk voor transducing de mechanische uitslag van het haar in een neuraal evenement (resulterend in een uitbarsting of inhibitie van AP's in de receptor cel axon 9. De AP's reizen naar de terminal buik ganglion (A6) via Cercal zenuw XI, waar ze synaps met gigantische axonen van de buikzenuwkoord (VNC). worden De reus axonen vermoedelijk verantwoordelijk voor de transmissie en de daaropvolgende excitatie van de motorische neuronen die resulteert in een ontsnapping gedrag 6,10,11 te zijn.
De gedrags-latency of de ontsnapping reactie van P. americana is een van de kortste van dieren van alle 7. Behavioral latency is de tijd tussen de aankomst van een stimulus op een mechanoreceptor en de inleiding van een ontsnapping respons. In experimenten met hoge snelheid cinematografie aan de ontsnappingspoging van een aanvallende pad te nemen, werd de kakkerlak waargenomen om te beginnen zijn beurt weg van het pad in ongeveer 40 msec (tijd van het begin van de tong uitbreiding om beweging 7,12 kakkerlak. Behulp van gecontroleerde wind pufjes , de gedrags-latentie zou kunnen worden verminderd tot 11 msec. Andere experimenten bleek dat een minimale wind trekje snelheid van 12 mm / msec (met een versnelling van 600 mm / msec 2) een ontsnapping reactie kan oproepen, terwijl nog lagere snelheden (3 mm / sec) veroorzaakt langzaam lopen kakkerlakken te stoppen met bewegen 12.
De sterke correlatie die meestal bestaat tussen reus vezel systemen en vluchtgedrag is goed gedocumenteerd 13,14. In insttoelagen waar een bepaalde cel is noodzakelijk en voldoende om een bepaald gedrag op te roepen de cel wordt aangeduid als een commando neuron 15,16. Giant interneuronen (GIS) in de wind ontsnapping circuit van P. americana zijn niet nodig voor de reflex. Dieren die experimenteel zijn weggenomen GI's nog steeds vertonen vluchtgedrag dus deze GI's worden niet als commando neuronen 17,18. Severing cervicale connectieven dat rostraal van de sensomotorische circuit zijn ook van invloed op het gedrag, wat aangeeft dat aflopende input van de hersenen heeft een effect op de vluchtrichting 19. Deze aspecten van fijne controle en redundantie zijn van cruciaal belang voor de overleving van het organisme en worden aangevuld door neurochemische modulatie via biogene aminen 20.
De P. americana zenuwkoord preparaat is een elegant model voor neuroethologists in de afgelopen tientallen jaren te beginnen met het baanbrekende werk van Roeder <sup> 21. Het laat leerlingen opnemen, weergeven en analyseren primaire activiteit van de zintuigen en de resulterende reactie door reusachtige interneuronen om hun inbreng 22,23,24. Naast het overbrengen van de idee dat identificeerbare neurale circuits ten grondslag liggen gedragsreacties op het milieu, moeten deze oefeningen een waardering voor de biologische bijdragen van deze gemeenschappelijke huishouding plaag inboezemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de redenen voor het tentoonstellen van technieken voor deze klassieke bereiding is dat de cerci systeem is geweest en nog is een actief gebied van onderzoek bij het aanpakken van vraagstukken van de ontwikkeling van de neurale circuits evenals vragen over synaptische herstel en regeneratie 26-31. Beide methoden te roepen activiteit in de kakkerlak buikzenuwkoord kan worden gebruikt om de effecten van farmacologische middelen of insecticiden zenuwstelselfunctie onderzoeken. Deze experimenten worden uitgevoerd door eenvoudig oplossen neuroactieve stoffen in zoutoplossing. Na het uitwisselen van deze oplossing met de normale baden medium, kunnen veranderingen in opgewekte of spontane activiteit in acht worden genomen tijdens het opnemen van connectieven of een motorische zenuw om een consistente uitlezing van het effect van de chemische stof op CNS functie geven.
Zoals in alle neurofysiologische experimenten een veel voorkomend probleem is elektrische ruis. Waarschijnlijk de grootste factor in de kwaliteit van het signaal voor deze voorbereidingen is de zuig-elektrode zegel op het zenuwweefsel. Een goede afdichting die niet geheel trekken in de Cercal zenuw of bindweefsel is ideaal. Opnames kunnen ook worden gemaakt met een dubbele haak elektroden onder de zenuw snoer en het isoleren van de VNC met een mengsel van minerale olie en vaseline geplaatst. Het mengsel kan in een injectiespuit worden geladen en uitgezet rond de zenuw snoer 32. Ook een zorgvuldige dissectie is hier zo kritisch als bij een ander CZS voorbereiding. Sommigen vinden het gemakkelijker om toegang te krijgen tot het CZS door het ontleden van de dorsale cuticula. Hoewel dit vermindert de kans op beschadiging van de buikzenuwkoord kan moeilijker zijn om alle ingewanden verwijderd met behulp van deze benadering.
Het is hier niet beschreven, maar dit preparaat vatbaar is voor intracellulaire opname in de reus interneuronen 32,33. De gehele zenuwkoord kan worden verwijderd om verschillende opname en stimulerende elektroden te huisvesten. In feite is de exploratie van de antennal kwab, champignon body, en andere voorste CNS structuren is nog in volle gang 34-35. Terwijl de kakkerlak CNS blijft om licht te werpen op de moderne neurobiologisch onderzoek dit bijzondere voorbereiding is eenvoudig genoeg om gebruikt te worden in undergraduate academische laboratoria.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Hyewon Cooper voor illustraties.
Materials
| Reagent | |||
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Material Name | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Full, R. J., Tu, M. S. Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion. J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).
- Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons. Science. 210, 443-445 (1980).
- Libersat, F., Camhi, J. M. Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback. J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).
- Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).
- Pipa, R. a. D., F, . The American Cockroach. , 175-216 (1981).
- Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).
- Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).
- Nicklaus, R. Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abhängigkeit von der Grösse und Richtung der Auslenkung. Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).
- Westin, J. Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).
- Ritzmann, R. E. . Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 93-131 (1984).
- Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).
- Plummer, M. R., Camhi, J. M. Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach – the role of wind acceleration. J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).
- Bullock, T. H. . Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 1-14 (1984).
- Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach. J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).
- Atwood, H. L., Wiersma, C. A. Command interneurons in the crayfish central nervous system. J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).
- Olson, G. C., Krasne, F. B. The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior. Brain Res. 214, 89-100 (1981).
- Comer, C. M. Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons. Brain Res. 335, 342-346 (1985).
- Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana. Brain Res. 445, 370-375 (1988).
- Keegan, A. P., Comer, C. M. The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit. Brain Res. 620, 310-316 (1993).
- Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach. J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).
- Roeder, K. D. Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana. J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).
- Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).
- Oakley, B., Schafer, R. Experimental neurobiology. , (1978).
- Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. . Laboratory exercises in invertebrate physiology. , (1968).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Bacon, J. P., Blagburn, J. M. Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets. Development. 115, 773-784 (1992).
- Blagburn, J. M. Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana. Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).
- Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity. J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).
- Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories. J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).
- Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus. J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).
- Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).
- Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior. J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).
- Blagburn, J. M. Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons. J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).
- Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach. Front. Sys. Neurosci. (6), 55 (2012).
- Nishino, H., et al. Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach. Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).
- Elia, A. J., Gardner, D. R. Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana. Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).
