Neural Circuit gravação de um Sistema Nervoso Barata Intacta
Summary
Este artigo descreve a barata ventral do nervo espinhal dissecção e gravações extracelular do nervo Cercal e conectivos. Respostas evocadas são gerados por estimulação elétrica do nervo Cercal ou estimulação mecânica direta da Cerci.
Abstract
A preparação cordão nervoso ventral barata é um sistema tratável para experimentos Neuroetologia, modelagem de rede neural, e testar os efeitos fisiológicos de inseticidas. Este artigo descreve o âmbito da barata modalidades sensoriais que podem ser utilizados para ensaiar a forma como um sistema nervoso de insectos às perturbações ambientais. A ênfase aqui é sobre o comportamento de fuga mediada por cercos a transmissão de fibra gigante em Periplaneta americana. Esta em preparação situ requer apenas habilidade de dissecação moderada e experiência eletrofisiológica para gerar gravações reprodutíveis de atividade neuronal. Os péptidos ou outros reagentes químicos podem, então, ser aplicada directamente para o sistema nervoso, em solução com a solução salina fisiológica. Insecticidas também pode ser administrado antes de dissecção e o circuito de fuga pode servir como um indicador para o estado excitável do sistema nervoso central. Neste contexto, os ensaios aqui descritos, também seriam úteis para resquisadores interessados na regeneração de membros e da evolução do desenvolvimento do sistema nervoso para que P. americana é um organismo modelo estabelecido.
Introduction
Existem mais de 4.000 espécies de baratas, mas apenas cerca de 30 são pragas domésticas. Talvez o mais reconhecido é o misnamed barata americana Periplaneta americana que teve origem na África, e agora é encontrada em quase toda parte do planeta. Além de sua rápida velocidade de corrida e um comportamento evasivo, nos trópicos P. americana é capaz de 2,3 vôo.
As características predominantes do sistema nervoso central barata (CNS) são a sua natureza segmentada ea descentralização do controle processa 4,5. O cérebro, torácica, abdominal e gânglios são unidos por conectivos interganglionic emparelhados para formar o cordão nervoso ventral (VNC).
Os gânglios em cada segmento estão integrando centros. Eles são compostos de, uma região cortical exterior contendo células responsáveis pela barreira de permeabilidade hemato-encefálica logo abaixo deles, eo somata de neurônios originar, em que o gânglio. Estes somata pode pertencer a interneurônios, neurônios moduladores, ou neurônios motores. Eles fornecem os axônios que permanecem dentro do gânglio de origem (interneuron local) ou axônios que se projetam entre os gânglios do sistema nervoso central (interneurons interganglionic) ou que terminam em células musculares periféricos (neurônios motores). A maioria somata estão posicionados ventralmente ou ventrolaterally no córtex ganglionar 5. Os pares, conectivos interganglionic conter apenas axônios e não corpos celulares neuronais.
O neuropil de um gânglio contém células da glia (glia), folhetos axônio, feixes de axônios e dendritos, (neurites) de neurônios. O neuropil é desprovido de corpos celulares neuronais. Esta é a região dentro do gânglio onde ocorrem comunicação sináptica direta entre as células nervosas e integração de entradas.
A capacidade da barata americana P. americana para detectar e de repente responder a um predador que se aproxima (pé, hand, etc.) tem sido atribuída a um circuito de reflex que consiste em cercos a 6,7 e o sistema de fibra gigante. O cercos são um par de estruturas, sensível ao vento dos sopros localizados na extremidade do abdómen (Figura 1). Em P. americana na superfície ventral de cada cercus contém cerca de 200 filiformes (thread) cabelos que estão organizados em 14 colunas. Nove destes colunas pode ser identificado de forma consistente em animais diferentes de acordo com as propriedades de resposta da célula do receptor associado e axónios. Cada cabelo é em um soquete que permite dobrar mais facilmente em um plano que é específico da coluna. Movimento dos cabelos em uma direção ao longo de seu avião induz uma despolarização da célula receptora e uma rajada de potenciais de ação (APs) no neurônio sensorial. Movimento na direção oposta inibe qualquer APs espontâneos em curso 8. O plano de deflexão preferida e direccionamento da resposta é diferente em cada coluna. Assim, o filiforcomplexos de receptores cabelo m são responsáveis não só para detectar o movimento do ar, mas também para "codificação", na forma de pontos de acesso, a direção da qual a corrente de ar originou. O processamento desta informação por parte do CNS resulta em um "adequado" resposta de fuga 6,7. Esta especificidade funcional, colunar dos pêlos sensoriais são preservados de animal para animal.
A célula receptora de cada cabelo filiforme é responsável pela transdução do deflexão mecânica do cabelo num evento neural (resultando numa explosão ou a inibição de AP em axónios de células do receptor de 9. Os APs viajar para o gânglio abdominal do terminal (A6), através de cercal XI nervo, onde sinapse com os axônios gigantes do cordão nervoso ventral (VNC). Os axônios gigantes se acredita ser responsável pela transmissão e excitação subseqüente de neurônios motores que resulta em um comportamento de fuga 6,10,11.
O comportamento de latência of a resposta de fuga de P. norte americana é uma das mais curtas de qualquer animal 7. Latência Comportamental é o tempo entre a chegada de um estímulo de um mecanorreceptor e o início de uma resposta de fuga. Em experimentos com cinematografia de alta velocidade para gravar a tentativa de fuga de um sapo de ataque, a barata foi observada para começar sua vez longe do sapo em cerca de 40 ms (tempo de início de extensão língua para barata movimento 7,12. Usando sopros de vento controlados , a latência de comportamento pode ser reduzida a 11 mseg. Outras experiências demonstraram que uma velocidade de vento de sopro mínimo de 12 mm / ms (com uma aceleração a 600 mm / ms 2) pode evocar uma resposta de fuga, ao passo que as velocidades ainda mais baixas (3 mm / seg) causou caminhando lentamente baratas parar de se mover 12.
A forte correlação que normalmente existe entre os sistemas de fibras gigantes e comportamento de fuga tem sido bem documentada 13,14. Em instlhos, em que é necessária e suficiente para provocar um comportamento particular uma célula em particular, a célula é referido como um neurónio de comando 15,16. Interneurons Gigante (IG) no circuito de fuga vento de P. americana não são necessárias para a reflex. Os animais que têm experimentalmente cauterizado soldados ainda exibem o comportamento de fuga, portanto, esses soldados não são considerados neurônios de comando 17,18. Cortando conectivos cervicais que são rostral ao circuito sensório também influencia o comportamento, o que indica que a entrada descendente a partir do cérebro tem um efeito sobre a direcção de evacuação 19. Esses aspectos do controle fino e redundância são fundamentais para a sobrevivência do organismo e são complementadas por modulação neuroquímica via aminas biogênicas 20.
O P. preparação cordão nervoso americana tem sido um sistema modelo elegante para neuroethologists nos últimos muitas décadas começando com o trabalho pioneiro de Roeder <sup> 21. Ele permite que os alunos de gravar, exibir e analisar a atividade sensorial primário e as respostas resultantes por interneurônios gigantes para sua 22,23,24 entrada. Além de transmitir a idéia de que os circuitos neurais subjacentes identificáveis respostas comportamentais ao meio ambiente, estes exercícios devem incutir uma apreciação para as contribuições biológicas feitas por esta praga comum do agregado familiar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma das razões para as técnicas exibindo para esta preparação clássica é que o sistema cerci foi e ainda é uma área ativa de pesquisa na abordagem de questões de desenvolvimento de circuitos neurais, bem como questões relacionadas com a reparação e regeneração sináptica 26-31. Qualquer um dos métodos de actividade de evocar no cordão nervoso ventral barata pode ser usado para examinar os efeitos de agentes farmacológicos ou de insecticidas na função do sistema nervoso. Estas experiências são feitas simplesmente por dissolução de produtos químicos neuroactivos em solução salina. Depois de trocar esta solução com o meio banho normal, mudanças na atividade evocada ou espontâneo pode ser observado durante a gravação de conectivos ou um nervo motor para dar uma leitura consistente do efeito da substância química em função do SNC.
Como em todos os experimentos neurofisiológicos um problema comum é o ruído elétrico. Provavelmente, o fator mais importante na qualidade de sinal para esses preparativos is a vedação do eléctrodo de sucção sobre o tecido nervoso. Um selo apertado que não chamar completamente no nervo Cercal ou conjuntivo é o ideal. Gravações também pode ser feita com eléctrodos de gancho duplos colocados sob o cordão nervoso e isolamento do VNC com uma mistura de óleo mineral e vaselina. A mistura pode ser carregada para uma seringa e expelido em torno do cabo de nervo 32. Também dissecação cuidadosa é tão crítico como aqui em qualquer preparação do SNC. Alguns podem achar que é mais fácil de acessar o CNS dissecando a cutícula dorsal. Enquanto isto reduz a possibilidade de danificar o cabo nervoso ventral pode ser mais difícil de remover todas as vísceras utilizando esta abordagem.
Não é descrito aqui, mas esta preparação é passível de gravação intracelular nos interneurónios gigantes 32,33. O cordão nervoso inteiro também pode ser removido para acomodar vários gravação e estimulantes eletrodos simultaneamente. Na verdade exploração do lobo antenal, bo cogumelody, e outras estruturas anteriores do sistema nervoso central ainda está em andamento 34-35. Enquanto a barata CNS continua a lançar luz sobre investigação neurobiológica moderno esta preparação especial é simples o suficiente para ser usado em laboratórios acadêmicos de graduação.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Hyewon Cooper para ilustrações.
Materials
| Reagent | |||
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Material Name | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
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