Neuronalen Schaltkreis-Aufnahme von einem intakten Nervensystem Schabe

1. Präparation Schabe in diesem Protokoll verwendeten Kochsalzlösung hat die folgende Zusammensetzung: Cockroach Kochsalzlösung 36: (Gramm für 100 ml) 210 mM NaCl (1.227 g) 2,9 mM KCl (0,0216 g) 1,8 mM CaCl 2 (0,0265 g) 0,2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1,8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7,2. Der pH-Wert mit 1 M NaOH oder 1 M HCl). Wählen Sie einen männlichen Kakerlake aus dem Vorratsbehälter, die robust Cerci (Abbildung 1). Die letzten Segmente des Mannes sind schmal im Vergleich zu den weiblichen, und die keine Eierstöcke und Eiermasse, sind Männer leichter zu sezieren. Die Männchen von P. americana ein Paar kurze Taster zwischen der Cerci. Diese Taster sind in den Weibchen beobachtet. Schneiden Sie die Flügel, Beine und Kopf und stecken den Körper, Bauchseite bis zu einer dish mit Silikon-Elastomer ausgekleidet. Mit Zange holen die Bauchplatten und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere, beginnend am hinteren Ende und nach vorne arbeiten. Die inneren Organe immer feucht zu halten mit Kochsalzlösung beim Versuch, die Cerci trocken zu halten. Man kann Wachs oder Stücke von Gummi verwenden, um den Bauch nach oben zu positionieren, um die Kochsalzlösung benetzt die Cerci zu verhindern. Wenn sie nass wird, trocknen Sie sie mit einem Stück Seidenpapier. Drücken Sie auf die Seite, die inneren Organe und die weiße Substanz (Fett-Körper). Der VNC ist in der Mitte des Feldes, läuft über die Länge des Bauches und sollte zwischen der glänzenden Tracheen sichtbar sein. Der Nervenstrang ist durchscheinend und kann anfangs schwierig sein, zu sehen, bis die Beleuchtung richtig (Abbildung 2) angepasst. NICHT behandeln die VNC mit einer Pinzette oder Insektenstifte; Verwendung von Glassonden statt manipulieren. Räumen Sie Tracheen-System der Tiere so gut wie möglich aus der Nervenstrang mit einer Zange und mit einem Paar von feinen Glas Notwendigkeitles, sehr sorgfältig spalten die VNC-Verknüpfungen in Längsrichtung zwischen A6 und A5 und A4-oder A5-Ganglien (Abbildung 3). Cradle die Cerci und Bauch nach oben aus dem Solebad mit verkürzten Insektenstifte und Wachs oder ein Keil des Silikon-Elastomers, die schneiden kann, um die Vorbereitung (4A und B) zu passen. Seien Sie in der letzten Bauchsegment nicht auf die Nerven, die cercal in die Ganglien projizieren beschädigen besonders vorsichtig (Figuren 2D und 5). 2. Extrazelluläre Aufnahme Die Vorbereitung seziert, Mikroskop, und Aufzeichnungsgerät sollte in einem Setup-Faraday-Käfig sein, externe, insbesondere AC, elektrische Felder, die Signale von Nervenzellen außer Kraft setzen konnte (Abbildung 6) zu blockieren. Positionieren Sie das Mikroskop, so dass es mit Blick auf den Mikroskoptisch. Sobald das Präparat auf der Bühne platziert, passen Sie die Position der Beleuchtungsstrahl hoher Intensitätfür die beste Visualisierung von ihm. Verbinden Sie den AC / DC-Differenzverstärker mit der integrierten Datenaufzeichnungseinheit (Details auf den spezifischen Hardware-und Software-Einstellungen wurden bereits beschrieben 25). Der Kopf der Bühne hält eine Saug-Elektrode sollte an den Verstärker angeschlossen werden. Eine silberne Erdungskabel, die mit Cl beschichtet worden ist – in den Bauch führt zu stabileren Aufnahmen eingefügt. Der Grund ist, wenn die Lösung in die Körperhöhle nicht in Kontakt mit der Badeflüssigkeit in der Schüssel, der mit der Aufzeichnungselektrode geerdet bleibt zugehörigen Fluid. Stellen Sie die Aufnahmefrequenz auf 4 kHz. Stellen Sie die Spannungsskala (y-Achse) bis 500 mV (dieser kann eingestellt werden, um die Visualisierung der Messkurve zu optimieren). Führen Sie das Aufnahme-Software in kontinuierlicher oder Oszilloskop-Modus, um neuronale Aktivität in Reaktion auf Reize aufzuzeichnen. Schneiden Sie eine der VNC-Verknüpfungen in der Nähe von A5 und legen Sie das Schnittende bis A6 in eine Saug-Elektrode angebracht. Achten Sie darauf, pull Salzlösung in die Saug-Elektrode, um die Silberdraht im Inneren vor dem Ansaugen in der Nerven abzudecken. Mit einer Pipette trocken blasen Luft an die Haare auf jeden cercus entfernt. Sehen Sie, wenn die Stimulierung der Haare auf dem cercus ipsilateral zu der aufgezeichneten Verbindungs ​​gibt eine andere Antwort als die kontralateralen ein. Nehmen die Amplituden der Reaktionen und der Anzahl der Spitzen in einem gegebenen Zeitintervall, während der Stimulation. Bewegen Sie die Saug-Elektrode mit einem cercal Nerven für die Aufnahme. Um eine bessere Passform, wechseln Sie zu einer Elektrodenspitze mit einer kleineren Öffnung bei Bedarf zu bekommen. Schneiden Sie die cercal Nerven Nähe von A6 und saugen dann die Nerven, die zum cercus. Es sollte spontane Abfeuern von Aktionspotentialen sein. Nun blasen Luft auf die cercus und beachten Sie die Antworten. 3. Elektrische Stimulation der sensorischen Nerven zu ermitteln Recruitment Ändern Sie den Aufnahme-Software zu fegen Modus, so dass es Aufzeichnungen Spuren (100-500 msec.) jedes Mal, wenn ein Reiz ausgelöst wird. Verbinden der Stimulationselektrode mit dem Ausgang des Stimulators. Verbinden Sie den Stimulator Kabel mit den beiden Mini-Haken Leitungen oder Clips. Die BNC-Trigger-Ausgang von dem Stimulator mit dem Triggereingang der Aufzeichnungseinheit. 10 ms, Frequenz::;: Dauer: Verzögerung 0,3 s Die folgenden Stimulationsparameter sollten eine Reaktion hervorrufen 1 Hz, Spannung: nach Bedarf anpassen, um ein Signal in den Aufnahmen zu erhalten (knapp über Schwelle und in der Lage, eine maximale Antwort zu erhalten). Es gibt keinen Grund zu Spannungen viel höher als maximale Schwellenwert für die Einstellung gehen, wie eine hohe Spannung beschädigt werden, um den Nerv. Schneiden Sie die cercal Nerven als distale wie möglich, so dass eine lange Nervenwurzel kann in der stimulierenden Elektrode Sog gezogen (Abbildung 7, Pfeilspitze) werden. Die Binde zwischen A6 und A5 oder ein anderes Segment weiter vorn verwendet werden. Stellen Sie den Aufnahme Saug-Elektrode, so können Sie puwerde ein Schnitt Binde in die Elektrode. Seien Sie sicher, etwas Kochsalzlösung in den Saug-Elektroden ziehen, um den Silberdraht im Inneren vor dem Ansaugen in den Nerven zu decken. Sicherzustellen, dass die Stimulationselektrode ist ebenfalls in dem Bad Salz geerdet (in der Bauchhöhle in der Nähe von A3 ist ideal). Liefern Sie eine Reihe von Einzelreize, aus zunehmender Spannung, bis ein Aktionspotential auf dem Bildschirm erscheint. Man sollte eine Aufzeichnung der minimalen Stimulationsspannung und Dauer machen, um eine Antwort zu rekrutieren. Erhöhen Sie die Intensität, bis eine Reaktion in den synaptischen Verknüpfungen beobachtet. Die große Spitze (extrazelluläre APs) von den riesigen Axone erscheint zuerst, und dann andere kleinere AP kann auch beobachtet werden.