Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

Os campos da neurofisiologia e biônica médica dependem fortemente de técnicas que permitem a estimulação controlável de respostas elétricas no tecido neural. Enquanto a estimulação elétrica continua sendo o padrão ouro em excitação neural, sofre de uma série de inconvenientes, tais como a presença de artefatos de estímulo durante a gravação de respostas neurais, e uma falta de especificidade estimulação devido à propagação de corrente em ^um tecido circundante.

As duas últimas décadas têm visto o desenvolvimento de técnicas de estimulação opticamente mediadas ^2. Várias destas técnicas requerem a modificação do tecido-alvo, quer através da adição de uma molécula em particular (por exemplo, moléculas em gaiolas) ³ ou alguma forma de manipulação genética (por exemplo, Optogenetics) ^4, nenhum dos quais são fáceis de aplicar do lado de fora de um ambiente de pesquisa. De particular interesse é, por conseguinte, a estimulação neural por infravermelhos (INS), whereby tecido neural é excitado por luz pulsada de laser infravermelho. INS tem o potencial para ultrapassar muitos dos problemas da estimulação eléctrica, permitindo altamente específico, a estimulação não-contacto do tecido neural ^2. No entanto, enquanto que o INS tem sido demonstrado com sucesso numa variedade de configurações, in vivo, o mecanismo exacto de excitação permanece incerto.

Algumas publicações recentes têm mostrado progresso para desvendar o mecanismo por trás INS ^5-7. Aquecimento rápido devido à absorção da luz do laser por água parece desempenhar um papel fundamental. No entanto, para além deste consenso ainda está para ser atingido. Shapiro et ai. ⁷ propor um mecanismo geral pelo qual altamente rápido aquecimento provoca uma perturbação na distribuição de partículas carregadas adjacentes à membrana celular, conduzindo a uma alteração na capacitância da membrana celular e subsequente despolarização. Além disso, Albert et al. ^Cinco afirmar que laser aquecimento induzido activa uma classe específica de canais de iões sensíveis à temperatura (receptor de potencial transiente canais vanilóides), permitindo que os iões passam através da membrana celular. Nesta fase, ainda não está claro como esses mecanismos se combinam, ou mesmo se existem outros factores que estão ainda a ser identificado.

Apesar de um pequeno número de publicações (Referências ^5,7-9) investigaram INS in vitro, a grande maioria dos trabalhos publicados neste campo foi realizado in vivo (por exemplo, as referências ^1,6,10-18). Estimulação dos neurônios auditivos infravermelho tem sido uma área de interesse particular, devido às potenciais aplicações em implantes cocleares ^10,14-18. Enquanto experimentos in vivo são importantes para verificar a eficácia da técnica em diversas configurações, o aumento do nível de controle oferecido por estudos in vitro deverá levar a uma compreensão mais detalhada do mechnismo responsável pelo INS. Este relatório descreve a preparação de culturas de neurônios do gânglio espiral para as investigações patch clamp, pois estes podem ser usados ​​para estudar os mecanismos fundamentais e ao mesmo tempo ligando para a grande massa de dados existentes no sistema auditivo.

A técnica de patch clamp é uma excelente ferramenta para investigações de fenômenos eletrofisiológicos, proporcionando um meio de registrar a atividade elétrica das células individuais e estudar a contribuição das correntes subjacentes individuais ^19. Quando esta técnica é aplicada a uma preparação estável na in vitro de neurónios primárias, tais como culturas de neurónios do gânglio espiral, oferece a oportunidade de estudar em profundidade os mecanismos pelos quais a actividade neural é controlada e manipulada.

Os protocolos especificados neste trabalho métodos esboço para investigar o efeito da estimulação a laser sobre as propriedades elétricas dos neurônios do gânglio espiral através de patch clampgravações. A abordagem baseia-se um laser de fibra de acoplamento, em vez de um laser de espaço livre, permitindo uma operação mais segura bem como mais fácil e reproduzível de alinhamento sem a necessidade de modificar a configuração do microscópio padrão. Com base nestes protocolos, deverá ser possível realizar uma vasta gama de ensaios de modo a determinar de forma mais clara o mecanismo ou os mecanismos por detrás do INS.