Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge
Summary
La stimulation du nerf infrarouge a été proposé comme alternative à une stimulation électrique dans une gamme de types nerveuses, y compris ceux qui sont associés avec le système auditif. Ce protocole décrit une méthode de patch-clamp pour l'étude du mécanisme de la stimulation du nerf infrarouge dans une culture de neurones auditifs primaires.
Abstract
Il a été démontré ces dernières années que la lumière laser pulsée, infrarouge peut être utilisé pour obtenir des réponses électriques dans le tissu neural, indépendante de toute autre modification du tissu cible. Stimulation neurale infrarouge a été rapporté dans une variété de tissu nerveux périphérique et sensorielle in vivo, avec un intérêt particulier représenté sur la stimulation de neurones dans le nerf auditif. Cependant, alors que l'INS a été montré à travailler dans ces milieux, le mécanisme (ou mécanismes) par lequel la lumière infrarouge provoque une excitation neuronale n'est actuellement pas bien compris. Le protocole présenté ici décrit une méthode de patch-clamp de la cellule entière conçue pour faciliter l'enquête de stimulation neurale infrarouge dans des cultures de neurones auditifs primaires. En caractérisant parfaitement la réponse de ces cellules à illumination laser infrarouge in vitro dans des conditions contrôlées, il peut être possible d'obtenir une meilleure compréhension de la physica fondamentalel et processus biochimiques sous-jacents stimulation neurale infrarouge.
Introduction
Les domaines de la neurophysiologie et la bionique s'appuient fortement sur les techniques qui permettent une stimulation contrôlable des réponses électriques dans le tissu neural. Alors que la stimulation électrique reste l'étalon-or en excitation nerveuse, elle souffre d'un certain nombre d'inconvénients tels que la présence d'artefacts de stimulation lors de l'enregistrement des réponses neuronales, et un manque de spécificité de la stimulation due à la propagation du courant dans les tissus environnants 1.
Les deux dernières décennies ont vu le développement des techniques de stimulation optiquement médiation 2. Plusieurs de ces techniques nécessitent la modification du tissu cible, soit par l'ajout d'une molécule particulière (molécules par exemple en cage) 3 ou une certaine forme de manipulation génétique (par exemple optogenetics) 4, qui ne sont faciles à appliquer en dehors d'un contexte de recherche. Un intérêt particulier est donc stimulation neurale infrarouge (INS), wherebY tissu neural est excité par une lumière laser infrarouge pulsé. INS a le potentiel pour surmonter bon nombre des lacunes de la stimulation électrique en permettant, stimulation sans contact très spécifique du tissu neural 2. Cependant, alors que l'INS a été démontrée avec succès dans une variété de paramètres in vivo, le mécanisme précis de l'excitation reste incertain.
Quelques publications récentes ont montré les progrès vers la découverte du mécanisme derrière INS 5-7. Chauffage rapide due à l'absorption de la lumière laser par l'eau semble jouer un rôle clé. Cependant, au-delà de ce consensus n'a pas encore été atteint. Shapiro et al. 7 proposer un mécanisme très général selon lequel le chauffage rapide provoque une perturbation de la distribution des particules chargées adjacentes à la membrane de la cellule, ce qui conduit à un changement de la capacitance de la membrane cellulaire et la dépolarisation ultérieure. En outre, Albert et al. 5 affirment que laser chauffage induite active une classe spécifique de température des canaux ioniques sensibles (récepteur transitoire des canaux vanilloïde potentiels), ce qui permet aux ions de passer à travers la membrane cellulaire. A ce stade, il est difficile de savoir comment ces mécanismes se combinent, ou bien si il ya d'autres facteurs qui n'ont pas encore été identifiés.
Bien qu'un petit nombre de publications (références 5,7-9) ont étudié INS in vitro, la grande majorité des travaux publiés dans ce domaine a été réalisée in vivo (par exemple, les références 1,6,10-18). Stimulation infrarouge de neurones auditifs a été un domaine d'intérêt particulier, en raison des applications potentielles dans les implants cochléaires 10,14-18. Bien que des expériences in vivo sont importantes pour vérifier l'efficacité de la technique dans divers milieux, l'augmentation du niveau de contrôle offert par des études in vitro devrait conduire à une compréhension plus détaillée de la mécaniquenisme responsable de l'INS. Ce rapport décrit la préparation de cultures de neurones du ganglion spiral pour les enquêtes de patch-clamp, car ils peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes fondamentaux tout en reliant à la grande quantité de données existantes du système auditif.
La technique de patch-clamp est un excellent outil pour les enquêtes sur les phénomènes électrophysiologiques, en fournissant un moyen d'enregistrer l'activité électrique des cellules individuelles et d'étudier la contribution des courants sous-jacents individuels 19. Lorsque cette technique est appliquée à une écurie préparation in vitro de neurones primaires, telles que les neurones du ganglion spiral culture, il offre la possibilité d'étudier en profondeur les mécanismes par lesquels l'activité neuronale est contrôlée et manipulée.
Les protocoles définis dans cette oeuvre les méthodes de contour pour étudier l'effet de la stimulation laser sur les propriétés électriques des neurones du ganglion spiral par patch clampenregistrements. L'approche est basée sur un laser à fibre couplée au lieu d'un laser en espace libre, ce qui permet le fonctionnement sûr et plus facile et plus reproductible alignement sans avoir à modifier la configuration du microscope standard. Sur la base de ces protocoles, il devrait être possible de procéder à un large éventail d'expériences afin de déterminer plus clairement le ou les mécanismes derrière INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant les protocoles décrits dans le présent document, il est possible d'extraire et de la culture des neurones du ganglion spiral et d'enquêter sur l'activité électrique au laser évoqué en effectuant ensemble des expériences de patch-clamp de la cellule. Lorsqu'ils sont utilisés in vitro, la technique de patch-clamp offre un niveau de contrôle sur les paramètres expérimentaux qui n'est pas réalisable in vivo. les paramètres de stimulation de laser tels que la l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil australien de la recherche sous Linkage subvention projet LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
References
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