Summary

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

Published: July 31, 2013
doi:

Summary

גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.

Abstract

זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח"י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.

Introduction

תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של ​​תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת 1.

בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך 2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) 3 או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) 4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח"י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית 2 מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח"י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור.

כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח"י 5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח'. 7 להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח'. 5 טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה.

למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות 5,7-9) חקרו אח"י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל 1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול 10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח"י. דו"ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה.

טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי 19 הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה.

הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח"י.

Protocol

1. תרבות של נוירונים גנגליון ספירלה לעקר עגול קטן (בקוטר 10 מ"מ לדוגמה) coverslips זכוכית ומלקחיים מעוקלים בחיטוי. העבר את coverslips מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית 4-טבעת 35 מ"מ פטרי או צלחת 4 היטב, תוך שימוש במלקח…

Representative Results

נוירונים הגנגליון ספירלה להגיב לתאורת לייזר עם צורות גל הדיר בשני תצורות הקלטה נוכחי, מהדק מתח ומהדק. 3a איור מראה שינויים אופייניים בזרימה הנוכחית על פני קרום תא בתגובה ל2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר, שחזרו במרווחים של 1 SEC) עם פו…

Discussion

שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי.</em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי תחת הצמדת פרויקט מענק LP120100264.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

References

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  8. Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

Play Video

Cite This Article
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

View Video