كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء
Summary
وقد اقترح تحفيز العصب تحت الحمراء كبديل للالتحفيز الكهربائي في مجموعة من أنواع العصبية، بما في ذلك تلك المرتبطة بالنظام السمعي. يصف هذا البروتوكول طريقة المشبك التصحيح لدراسة آلية تحفيز العصب الأشعة تحت الحمراء في ثقافة من الخلايا العصبية السمعية الأولية.
Abstract
وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن نابض، ضوء ليزر الأشعة تحت الحمراء يمكن استخدامها لانتزاع استجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية، مستقلة عن أي تعديل آخر على النسيج المستهدف. تم الإبلاغ عن التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مجموعة متنوعة من الأنسجة العصبية الطرفية الحسية في الجسم الحي و، باهتمام خاص هو مبين في تحفيز الخلايا العصبية في العصب السمعي. ومع ذلك، في حين لم تظهر INS للعمل في هذه الأماكن، الآلية (أو الآليات) التي ضوء الأشعة تحت الحمراء يسبب الإثارة العصبية حاليا ليست مفهومة جيدا. بروتوكول المعروضة هنا يصف التصحيح خلية كاملة طريقة المشبك مصممة لتسهيل التحقيق في التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مثقف الخلايا العصبية السمعية الأولية. بواسطة تميز بدقة استجابة هذه الخلايا إلى إضاءة ليزر الأشعة تحت الحمراء في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، قد يكون من الممكن للحصول على فهم أفضل للفيزيكا الأساسيةL والعمليات الكيميائية الحيوية التي تقوم عليها التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء.
Introduction
مجالات الفسيولوجيا العصبية والطبية البيولوجية الالكترونية تعتمد بشكل كبير على التقنيات التي تسمح التحفيز يمكن السيطرة عليها من الاستجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية. بينما التحفيز الكهربائي لا يزال المعيار الذهبي في الإثارة العصبية، أنها تعاني من عدد من السلبيات مثل وجود القطع الأثرية التحفيز عند تسجيل الاستجابات العصبية، وعدم وجود خصوصية التحفيز نظرا لانتشار الحالية إلى الأنسجة المحيطة 1.
شهدت خلال العقدين الماضيين تطوير بصريا تقنيات التحفيز بوساطة 2. العديد من هذه التقنيات تتطلب التعديل من الأنسجة المستهدفة، إما عن طريق إضافة جزيء معين (على سبيل المثال الجزيئات في قفص) 3 أو شكلا من أشكال التلاعب الجيني (على سبيل المثال optogenetics) 4، لا من التي من السهل أن يطبق خارج إعداد البحوث. ذات أهمية خاصة لذلك هو التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء (INS)، wherebهو متحمس Y الأنسجة العصبية بواسطة نابض ضوء الليزر تحت الحمراء. INS لديه القدرة على التغلب على كثير من أوجه القصور في التحفيز الكهربائي من خلال تمكين محددة للغاية، والتحفيز وعدم الاتصال من الأنسجة العصبية 2. ومع ذلك، فإنه بينما ثبت INS بنجاح في مجموعة متنوعة من إعدادات في الجسم الحي، وآلية دقيقة من الإثارة لا يزال غير مؤكد.
وقد أظهرت بعض المنشورات الحديثة التقدم نحو كشف آلية وراء INS 5-7. التسخين السريع بسبب امتصاص ضوء الليزر من قبل الماء ويبدو أن تلعب دورا رئيسيا. ومع ذلك، وراء هذا الإجماع لم يتحقق بعد. شابيرو وآخرون. 7 اقتراح آلية عامة للغاية حيث يسبب التسخين السريع اضطراب في توزيع الجسيمات المشحونة المتاخمة لغشاء الخلية، مما يؤدي إلى تغيير في السعة من غشاء الخلية والاستقطاب اللاحقة. وبالإضافة إلى ذلك، ألبرت وآخرون. 5 يؤكدون أن عالج بالليزرR الناجم عن التدفئة ينشط فئة معينة من درجة الحرارة القنوات الأيونية الحساسة (مستقبلات عابر قنوات الأنانداميد المحتملة)، والسماح لتمرير الأيونات عبر غشاء الخلية. في هذه المرحلة ليس واضحا كيف الجمع بين هذه الآليات، أو في الواقع ما إذا كانت هناك عدة عوامل أخرى لا يزال يتعين تحديدها.
على الرغم من أن عدد قليل من المطبوعات (المراجع 5،7-9) حققت INS في المختبر، وقد تم تنفيذ الغالبية العظمى من الأعمال المنشورة في هذا المجال في الجسم الحي (مثل المراجع 1،6،10-18). وقد تم تحفيز الأشعة تحت الحمراء من الخلايا العصبية السمعية وهي منطقة ذات أهمية خاصة، نظرا لالتطبيقات المحتملة في زراعة قوقعة 10،14-18. بينما في التجارب المجراة مهمة للتحقق من فعالية هذه التقنية في مختلف البيئات، وزيادة مستوى الرقابة التي يوفرها في الدراسات المختبرية ومن المتوقع أن يؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا للالميكانيكيةanism المسؤولة عن INS. يصف هذا التقرير إعداد الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية للتحقيقات المشبك التصحيح، وهذه يمكن استخدامها لدراسة آليات الأساسية في سياق ربط أيضا إلى مجموعة كبيرة من البيانات الموجودة في الجهاز السمعي.
تقنية المشبك التصحيح هو أداة ممتازة لتحقيقات من الظواهر الكهربية، وتوفير وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي في الخلايا واحد ودراسة مساهمة التيارات الكامنة الفردية 19. عندما يتم تطبيق هذه التقنية لمستقر في إعداد المختبر من الخلايا العصبية الأولية، مثل الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية، فإنه يوفر الفرصة للدراسة في عمق الآليات التي يتم التحكم النشاط العصبي والتلاعب بها.
البروتوكولات المحددة في هذا العمل أساليب مخطط للتحقيق في تأثير التحفيز الليزر على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية العقدة الحلزونية من خلال التصحيح المشبكالتسجيلات. ويستند هذا النهج على الليزر الألياف الديناميكي بدلا من الليزر في الفضاء الحر، مما يسمح بتشغيل أكثر أمنا وكذلك أسهل وأكثر تكرار المواءمة دون الحاجة إلى تعديل تكوين المجهر القياسية. على أساس من هذه البروتوكولات، وينبغي أن يكون من الممكن إجراء مجموعة واسعة من التجارب من أجل تحديد أكثر وضوحا الآلية أو الآليات وراء INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة أنه من الممكن استخراج والثقافة دوامة الخلايا العصبية العقدية والتحقيق الليزر أثار النشاط الكهربائي قبل تنفيذ كامل الخلية التصحيح التجارب المشبك. عندما تستخدم في المختبر، ويوفر تقنية المشبك التصحيح مستوى من السيطر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي تحت ربط مشروع المنحة LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
