Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het ​​opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel ^1.

De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken ² gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelweefsel, via de toevoeging van een bepaald molecuul (bijv. gekooide moleculen) ³ of enige vorm van genetische manipulatie (bijv. optogenetics) ^4, die geen van beide gemakkelijk buiten onderzoeksverband te passen. Van bijzonder belang is dan ook infrarood neurale stimulatie (INS), whereby zenuwweefsel wordt opgewekt door gepulseerd infrarood laserlicht. INS heeft de potentie om veel van de tekortkomingen van elektrische stimulatie overwinnen doordat zeer specifieke, contactloze stimulatie van zenuwweefsel ^2. Hoewel INS met succes aangetoond in diverse instellingen in vivo, het precieze mechanisme van excitatie blijft onzeker.

Enkele recente publicaties hebben aangetoond vooruitgang naar het blootleggen van het mechanisme achter INS ^5-7. Snelle verwarming als gevolg van absorptie van het laserlicht door het water lijkt een belangrijke rol te spelen. Daarnaast echter een consensus nog worden bewerkstelligd. Shapiro et al.. ⁷ stellen een zeer algemeen mechanisme waarmee snel verwarmen veroorzaakt een verstoring in de verdeling van geladen deeltjes naast de celmembraan, wat leidt tot een verandering in de capaciteit van de celmembraan en daaropvolgende depolarisatie. Bovendien Albert et al.. ⁵ beweren dat laser geïnduceerde verwarming activeert een specifieke klasse van temperatuurgevoelige ionkanalen (transient receptor potential vanilloid kanalen), waardoor ionen om door het celmembraan. In dit stadium is het onduidelijk hoe deze mechanismen te combineren, of zelfs of er andere factoren die nog moeten worden geïdentificeerd.

Hoewel een klein aantal publicaties (referenties ^5,7-9) INS hebben in vitro onderzocht, heeft de overgrote meerderheid van het werk gepubliceerd op dit gebied is uitgevoerd in vivo (bv. referenties ^1,6,10-18). Infrarode stimulatie van de auditieve neuronen is een gebied van bijzonder belang, gezien de potentiële toepassingen in cochleaire implantaten ^10,14-18. Terwijl in vivo experimenten zijn belangrijk voor de effectiviteit van de techniek in verschillende instellingen, over de toegenomen geboden door in vitro studies controle naar verwachting leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de mech controlerennisme verantwoordelijk voor de INS. Dit rapport beschrijft de bereiding van gekweekte ganglion spirale neuronen voor patch clamp onderzoeken, omdat deze kunnen worden gebruikt om fundamentele mechanismen bestuderen tegelijkertijd verbinden met de grote hoeveelheid bestaande gegevens uit het gehoorsysteem.

De patch clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van elektrofysiologische fenomenen, een middel van het opnemen van elektrische activiteit in enkele cellen en het bestuderen van de bijdrage van de individuele onderliggende stromingen ^19. Wanneer deze techniek wordt toegepast op een stabiele in vitro bereiding van primaire neuronen, zoals gekweekte ganglion spirale neuronen, biedt de mogelijkheid te bestuderen in de mechanismen waardoor neurale activiteit wordt gecontroleerd en gemanipuleerd diepte.

De in dit werk schema onderzoeken van het effect van laserstimulatie op de elektrische eigenschappen van de ganglion spirale neuronen door patch clamp protocollenopnames. De benadering is gebaseerd op een vezel-gekoppelde laser in plaats van een vrije ruimte laser, waardoor veiliger werken en gemakkelijker en herhaalbare uitlijning zonder de standaard microscoop configuratie te wijzigen. Op grond van deze protocollen, moet het mogelijk zijn een groot aantal experimenten om meer duidelijk het mechanisme of mechanismen achter INS.