Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

I campi della neurofisiologia e della bionica medica si basano molto sulle tecniche che consentono la stimolazione controllabile di risposte elettriche nei tessuti nervosi. Mentre la stimolazione elettrica rimane il gold standard nella eccitazione neurale, soffre di una serie di inconvenienti, quali la presenza di artefatti di stimolazione quando si registra risposte neurali, e una mancanza di stimolazione specificità dovuta alla diffusione di corrente nel tessuto circostante ^1.

Gli ultimi due decenni hanno visto lo sviluppo di tecniche di stimolazione otticamente mediate ^2. Molte di queste tecniche richiede modificazione del tessuto bersaglio, tramite l'aggiunta di una particolare molecola (molecole es gabbia) ³ o qualche forma di manipolazione genetica (es. optogenetics) ^4, nessuno dei quali è facilmente applicabile al di fuori di un ambiente di ricerca. Di particolare interesse è dunque stimolazione neurale infrarossi (INS), whereby tessuto neurale è eccitato dalla luce laser infrarossa pulsata. INS ha il potenziale per superare molte delle carenze della stimolazione elettrica, consentendo altamente specifico, senza contatto stimolazione del tessuto neurale ^2. Tuttavia, mentre INS è stata dimostrata con successo in una varietà di impostazioni in vivo, il meccanismo preciso di eccitazione rimane incerta.

Alcune pubblicazioni recenti hanno dimostrato progressi verso scoprire il meccanismo che sta dietro INS ^5-7. Rapido riscaldamento dovuto all'assorbimento della luce laser da acqua sembra giocare un ruolo chiave. Tuttavia, al di là di questo un consenso deve ancora essere raggiunto. Shapiro et al. ⁷ propongono un meccanismo molto generale che riscaldamento rapido provoca una perturbazione nella distribuzione di particelle cariche adiacenti alla membrana cellulare, portando ad una variazione della capacità della membrana cellulare e conseguente depolarizzazione. Inoltre, Albert et al. ⁵ affermare che Laser riscaldamento indotto attiva una specifica classe di temperatura canali ionici sensibili (recettore vanilloide potenziale transiente canali), permettendo agli ioni di passare attraverso la membrana cellulare. In questa fase non è chiaro come questi meccanismi combinano, o anche se vi sono ulteriori fattori che sono ancora da identificare.

Anche se un piccolo numero di pubblicazioni (riferimenti ^5,7-9) hanno indagato INS in vitro, la stragrande maggioranza dei lavori pubblicati in questo campo è stata effettuata in vivo (ad es riferimenti ^1,6,10-18). Stimolazione infrarossi dei neuroni uditivi è stata una zona di particolare interesse, a causa delle potenziali applicazioni in impianti cocleari ^10,14-18. Mentre esperimenti in vivo sono importanti per verificare l'efficacia della tecnica in varie impostazioni, l'aumento del livello di controllo offerta da studi in vitro dovrebbe portare ad una comprensione più dettagliata del meccanismosmo responsabile INS. Questo rapporto descrive la preparazione di colture di neuroni del ganglio spirale per le indagini di patch clamp, in quanto questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi fondamentali, mentre anche il collegamento per la grande quantità di dati esistenti dal sistema uditivo.

La tecnica patch clamp è un eccellente strumento per ricerche di fenomeni elettrofisiologici, fornendo un mezzo di registrazione dell'attività elettrica in cellule singole e studiando il contributo delle singole correnti sottostanti ^19. Quando questa tecnica viene applicata a una stalla in preparazione in vitro di neuroni primari come coltura spirale neuroni gangliari, che offre l'opportunità di studiare in modo approfondito i meccanismi con cui l'attività neurale è controllato e manipolato.

I protocolli specificati in questo lavoro metodi di contorno per investigare l'effetto della stimolazione laser sulle proprietà elettriche dei neuroni del ganglio spirale attraverso Patch Clampregistrazioni. L'approccio è basato su un laser accoppiato in fibra piuttosto che un laser a spazio libero, consentendo un funzionamento più sicuro e più facile e più ripetibile allineamento senza la necessità di modificare la configurazione microscopio standard. Sulla base di questi protocolli, dovrebbe essere possibile effettuare una vasta gamma di esperimenti per determinare con maggiore precisione il meccanismo o meccanismi dietro INS.