Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови
Summary
Здесь мы опишем протокол для выделения подмножеств предшественники В-клеток из пуповинной крови. Достаточное количество и качество нуклеиновые кислоты могут быть извлечены из клеток и используется в последующих анализах использованием ДНК или РНК.
Abstract
Пуповинная кровь высоко обогащенные для гемопоэтических клеток-предшественников на разных этапах приверженность линии. Мы разработали протокол для выделения предшественники В-клеток в четырех разных стадиях дифференцировки. Потому что гены экспрессируются и эпигенетические изменения происходят в тканях определенным образом, жизненно важно различать тканей и типов клеток для того, чтобы быть в состоянии идентифицировать изменения в геноме и эпигенома, что может привести к развитию заболеваний. Этот метод может быть адаптирован к любой тип клеток, присутствующих в пуповинной крови на любой стадии дифференцировки.
Этот метод включает в себя 4 основных этапа. Во-первых, одноядерные клетки разделены плотности центрифугирования. Во-вторых, B-клетки обогащаются использованием биотином антителами, которые признают и удаления не B-клеток из моноцитов. Третий B-клетки флуоресцентно меченые клетки с поверхности белка антител, специфичных к отдельным стадиямВ-клеточного развития. Наконец, флуоресцентно меченые клетки сортируются и отдельных групп населения будут восстановлены. Полученные клетки имеют достаточного количества и качества, которые будут использоваться в последующих анализах нуклеиновых кислот.
Introduction
Для того чтобы определить аберрации, которые находятся в болезни, очень важно, что мы используем здоровых тканей или клеток, которые соответствуют тканей или клеток типа, страдающих этим заболеванием. Одной из причин этого является то, что эпигенетические изменения у типов тканей несет ответственность за регуляции экспрессии генов и является критическим для дифференциации клеток во время нормального человеческого 1,2 развитием. Второй причиной является то, что аберрантных ткани специального регулирования ген может иметь тяжелые последствия для нормального развития и, как известно, способствует множество болезненных состояний, включая рак. Таким образом, лучше понять болезнь, которая включает в себя гемопоэтических клеток требует знания здоровых гемопоэтических клеток.
Развитие кроветворных клеток в костном мозге доходов путем систематического порядок событий характеризуются изменения в экспрессии маркеров клеточной поверхности 3. Исследования с участием взрослых участников естьПоказано, что костный мозг обычно содержит небольшое количество прекурсоров В-клеток 4,5, тогда как исследования с участием педиатрической участников показали, что процент предшественника B-клеток является относительно высокая у людей меньше, чем 5 лет 6. Пуповинная кровь используется в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток в лечении расстройств, связанных с кровью и злокачественных опухолей, легко доступны через банки пуповинной крови и обогащается для незрелых B и Т-клетки 7, которые являются клетками-мишенями нескольких заболеваний, включая лейкемию и лимфомы.
Предшественник B-клеток в костном мозге были широко phenotyped 8,9 и может быть определено наличие специфических маркеров клеточной поверхности, которые могут быть использованы для сортировки этих клеток в различных подмножеств. Нормальный B-клеточной дифференцировки проходит через ряд этапов в костном мозге, начиная с самых ранних про-В-клеток и заканчивая незрелых или наивные В-клеток. Пован Zelm и коллеги 10, про-В-клетки характеризуются наличием CD34 и в переходе к стадии 2 (Pre-BI) CD19 приобретения. Этап 3 (Pre-ВП) клетки больше не экспресс CD34 и начинают выражать цитоплазматических IgM. Наконец, отличительной чертой стадии 4 (незрелых В-клеток) является выражением поверхности IgM. Сортировка стратегии, описанной в данном протоколе была впервые описана Caldwell и коллег 6 и включает в себя использование только 3 маркеров клеточной поверхности, что значительно снижает сложность и стоимость проведения экспериментов сортировки клеток. В своей работе, отношения между CD45 и этапы B-клеточной дифференцировки была создана. Они отметили, что B-клеток в костном мозге отображать различные уровни экспрессии CD45. В частности, клетки, которые выразили высокий уровень CD45 соответствовало клетки, которые выразили поверхности IgM (незрелых В-клеток), те, которые выразили среднего уровня CD45 соответствовало клетки, которые выразили cytoplasmic IgM (предварительно BII клетки), и те, которые выражены низкие уровни CD45 соответствовало клетки, которые не выражают цитоплазматических IgM (предварительно BI клеток). Этот протокол использует стратегию, разработанную Caldwell и коллег от 6 до изолировать подмножества предшественники В-клеток из пуповинной крови (рис. 1), которые могут быть использованы в последующих анализах требующих высокого качества нуклеиновые кислоты, такие как метилированные CpG-анализа восстановление острова (MIRA ) 11 и количественный ПЦР в реальном времени анализы. Метод использует начальные разделения с использованием магнитных шариков, чтобы исчерпать все не-В-клеток из пуповинной крови и не требует окрашивания только с 3 антител (CD34, CD19 и CD45). Клетки, которые выделяют 4 стадии представляют В-клеточной дифференцировки: 1) CD34 +; CD19 + (поздно Pro-B и начале предварительного BI), 2) CD34 -, CD19 +, CD45 низкой (в конце предварительной BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 мед (до ВП) и 4) CD34 -; CD19 +; CD45 высокой (незрелых В-клеток).
Protocol
Representative Results
Discussion
Фактор, наибольшее влияние на успех протокола является наличие загрязнения мусором. Если запрашивающий кровь из банка пуповинной крови очень важно, чтобы кровь отправлены, как только после сбора, как это возможно. Кроме того, образцы, которые классифицируются как лимфоцитоз содержат большее количество лимфоцитов, однако эти образцы не имеют достаточного количества предшественников В-клеток и не должна быть использована. Чтобы увеличить вероятность получения достаточного количества клеток для каждого из предшественников подмножества мы рекомендуем начиная по крайней мере с 85 мл пуповинной крови.
Важно отметить, что в отличие от взрослых периферической крови разделений, когда фракционирования пуповинной крови мононуклеарных слоя часто загрязнены красных кровяных клеток 12. Этот протокол включает в себя дополнительный шаг мыть, чтобы удалить загрязнения тромбоцитов. Протоколы описания мононуклеарных расстояния из пуповинной крови предлагают в том числе т шаг лизисO удаления нежелательных красных кровяных клеток. Мы не рекомендуем этот шаг, поскольку он производит загрязнение мусором и оказывает негативное влияние на успех ячейки рода.
Для того, чтобы уменьшить количество ячеек, которые должны быть выделены проточной цитометрии необходимо выполнить B-клетки обогащения до сортировки клеток. Протокол, предоставляемый Miltenyi Biotec, который сопровождает B-изолятор Kit (В-ХЛЛ), была оптимизирована для периферической крови и рекомендует использовать 10 мкл В-ХЛЛ биотином антитела коктейль за 10 миллионов клеток. На этом этапе используются антитела против CD2 (Т-клетки, NK-клетки), CD4 (Т-клетки), CD11b (гранулоциты, моноциты, макрофаги), CD16 (NK клеток, макрофагов, тучных клеток), CD36 (тромбоциты), CD235a (эритроидных клеток) истощать, не-B клеток из пуповинной крови. Важно использовать набор описанных и не B-изолятор комплект II, потому что бывшие комплект содержит антитела против CD43, который присутствует на про-В-клеток. Во время нашего опtimization этого протокола, мы обнаружили, что в общей сложности 40 мкл В-ХЛЛ коктейль антител биотин, достаточно для получения положительного результата рода клетки. Кроме того, мы обнаружили, что использование всего лишь 5 мкл больше В-ХЛЛ коктейль антител биотин оказывают неблагоприятное воздействие на клетки рода. Поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать 40 мкл В-ХЛЛ коктейль антител биотин для общего мононуклеарных номера сотовых между 175-250 миллионов. Если, начиная с нижнего или выше количества клеток может быть необходимо для расширения реагентов соответственно.
Есть множество противоречивых публикаций, описывающих маркеры, которые могут быть использованы для различения субпопуляции В-клеток. Большинство расхождение можно объяснить тем, что дифференциация непрерывный процесс, и что наличие или отсутствие маркеров клеточной поверхности происходит в постепенном образом, а не в все или ничего манере. В этом протоколе CD34 – / CD19 + и уровень интенсивности CD45 + (низкий, средний, высокий) выражение используется, чтобы различать предварительно BI, предварительно BII и незрелых В-клеток с повышением уровня экспрессии CD45 соответствующие прогрессии дифференциации 6. Pro-B клетки были описаны некоторые, CD19 + / CD34 + 13 в то время как другие показали, что про-В-клетки CD19 – / CD34 + и предварительно BI клетки CD19 + / CD34 + 9,10. Основываясь на этих расхождениях мы обозначили CD19 + / CD34 + клеток, как в конце про-В-клеток / начале предварительного BI клеток. Важно отметить, что эта стратегия была разработана, чтобы изолировать подмножества предшественники В-клеток, которые соответствуют клетки, страдающих этим заболеванием острым лимфобластным лейкозом. Однако, есть несколько сортировки стратегий, которые могут быть использованы в зависимости от клетки подтипа интерес.
Антитела-флуорохромом комбинации должны быть выбраны исходя из возможностей имеющегося сортировщик клеток. Как родамл правило, самые яркие флуорохромом в панели должны быть использованы для обозначения наименее населенный антиген, и наоборот. В обнаружения двойной окрашенных населения, особенно редких событий, таких, как эти, дублет дискриминации (рис. 2В) является жизненно важной частью литниковой стратегии. Это гарантирует, что двойные позитивные события действительно одна клеток, окрашенных с обеих антител, а не просто две отдельные окрашенные клетки придерживаться друг друга.
Высокая скорость, 4-х сортировки клеток обязательно создает контролируемую среду аэрозолей. Таким образом, живые человеческие сортировки клеток должны проводиться с большой осторожностью. Опубликовано безопасности и обеззараживания принципов имеются в наличии и должны быть пересмотрены и реализованы до рода 14. Утверждение от институционального комитета по биобезопасности или их эквивалентов может потребоваться до сортировки. Для надлежащего обеззараживания после сортировки, дезинфицирующие средства должны быть добавлены в контейнер для отходов до конечной концентрации 10%. Сиmilarly, все образцы труб, а также все поверхности в непосредственной близости должны быть тщательно обеззаражены свежеприготовленный 10% раствор отбеливателя.
В целом, этот протокол обеспечивает стратегию для получения редких популяций предшественников В-клеток и могут быть изменены, чтобы изолировать любого редкого населения присутствует в пуповинной крови, в том числе гемопоэтических стволовых клеток и незрелых Т-клеток. Недавно незрелых клеток были выявлены в периферической крови пациентов с поздними стадиями ВИЧ 15. Таким образом, полезность этого метода выходит за рамки изучения рака крови. Наконец, мы еще не выполнили РНК изоляции на поток отсортированных клеток, однако этот метод должен быть адаптирован с оговоркой, что во время сортировки клеток, клетки должны быть отсортированы непосредственно в TRIzol или эквивалентной РНК-совместимых решений, таких как RLT из набора RNeasy через Qiagen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья (NCI R00 CA132784) для KT
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature?. Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
